hematologia practica

Edición en español de la 10.a edición de la obra original en inglés Dacie and Lewis. Practical Haematology Copyright © MMVI, Elsevier Ltd. Traducción Pedro L. Donado Pintado Médico Revisión científica Jordi Juncà i Piera Doctor en Medicina, Especialista en Hematología; Jefe de Sección, Laboratorio de Hematología, Hospital Germans Trias i Pujol, Badalona (Barcelona)

© 2008 Elsevier España, S.A. Infanta Mercedes, 90, 7.a planta - 28020 Madrid, España Fotocopiar es un delito (Art. 270 C.P.) Para que existan libros es necesario el trabajo de un importante colectivo (autores, traductores, dibujantes, correctores, impresores, editores...). El principal beneficiario de ese esfuerzo es el lector que aprovecha su contenido. Quien fotocopia un libro, en las circunstancias previstas por la ley, delinque y contribuye a la «no» existencia de nuevas ediciones. Además, a corto plazo, encarece el precio de las ya existentes. Este libro está legalmente protegido por los derechos de propiedad intelectual. Cualquier uso fuera de los límites establecidos por la legislación vigente, sin el consentimiento del editor, es ilegal. Esto se aplica en particular a la reproducción, fotocopia, traducción, grabación o cualquier otro sistema de recuperación de almacenaje de información. ISBN edición original: 978-0-443-06660-3 ISBN edición española: 978-84-8086-229-5 Depósito Legal: BI. 2497 - 2007 Composición y compaginación: Fotoletra, S. A. Impreso en España por Grafo, S.A.

Advertencia La medicina es un área en constante evolución. Aunque deben seguirse unas precauciones de seguridad estándar, a medida que aumenten nuestros conocimientos gracias a la investigación básica y clínica habrá que introducir cambios en los tratamientos y en los fármacos. En consecuencia, se recomienda a los lectores que analicen los últimos datos aportados por los fabricantes sobre cada fármaco para comprobar la dosis recomendada, la vía y duración de la administración y las contraindicaciones. Es responsabilidad ineludible del médico determinar las dosis y el tratamiento más indicado para cada paciente, en función de su experiencia y del conocimiento de cada caso concreto. Ni los editores ni los directores asumen responsabilidad alguna por los daños que pudieran generarse a personas o propiedades como consecuencia del contenido de esta obra. El Editor

Autores

Barbara J. Bain, FRACP, FRCPath Imperial College Faculty of Medicine St. Mary’s Hospital Londres, Reino Unido

Sue Knowles, BSc, MB, FRCP, FRCPath Department of Haematology St. Helier’s Hospital Carshalton, Surrey, Reino Unido

Imelda Bates, MD, FRCP, FRCPath Liverpool School of Tropical Medicine University of Liverpool Liverpool, Reino Unido

Mike Laffan, DM, FRCP, FRCPath Department of Haematology Imperial College Faculty of Medicine Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido

Sheena Blackmore CSci, FIBMS Department of Haematology Good Hope Hospital NHS Trust Birmingham, Reino Unido Anne Bradshaw, BSc, FIBMS, DMLM Department of Haematology Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido Daniel Catovsky, FRCP, FRCPath, DSc, FMedSci Royal Marsden Hospital The Institute of Cancer Research Londres, Reino Unido

Mark D. Layton, FRCP, FRCPCH Department of Haematology Imperial College Faculty of Medicine Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido S. Mitchell Lewis, BSc, MD, FRCPath, DCP, FIBMS Department of Haematology Imperial College School of Medicine Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido

Barbara De la Salle, MSc, CSci, FIBMS UK NEQAS (H) Watford General Hospital Watford, Reino Unido

Richard Manning, BSc, FIBMS Department of Haematology Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido

Inderjeet Dokal, MD, FRCP, FRCPath Department of Haematology Imperial College Faculty of Medicine Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido

Estella Matutes, MD, PhD, FRCPath Royal Marsden Hospital The Institute of Cancer Research Londres, Reino Unido

Malcolm Hamilton, MRCP, FRCPath Haematology Department Good Hope Hospital Sutton Coldfield, Reino Unido

Barry Mendelow, MD Department of Haematology University of Witwatersrand Johannesburg, Sudáfrica

Jaspal Kaeda, PhD, FIBMS, GiBiol Department of Haematology Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido

Clare Milkins, BSc, CSci, FIBMS UK NEQAS (BGS) Watford General Hospital Watford, Reino Unido

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Ricardo Morilla, MSc Royal Marsden Hospital Department of Academic Haematology Londres, Reino Unido Fiona Regan, MRCP, MRCPath Department of Haematology Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido David Roper, FIBMS, MSc Department of Haematology Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido

Noriyuki Tatsumi, MD, PhD International Buddhist University Osaka, Japan Tom Vulliamy, BA, PhD Department of Haematology Hammersmith Hospital Londres, Reino Unido Barbara Wild, PhD, FIBMS Department of Haematology King’s College Hospital Londres, Reino Unido

Megan Rowley, FRCP, FRCPath Department of Haematology Kingston Hospital Kingston, Reino Unido

Nay Win, FRCP, FRCPath Red Cell Immunohaematology National Blood Service: Tooting Centre Londres, Reino Unido

David Swirsky, FRCP, MRCPath Department of Haematology Leeds General Infirmary Leeds, Reino Unido

Mark Worwood, BSc, PhD, FRCPath, FMed Sci Department of Haematology Cardiff University School of Medicine Heath Park, Cardiff, Reino Unido

Prefacio

Esta 10.ª edición celebra el 55 aniversario de Hematología Práctica. Tanto la primera edición de J.V. Dacie de 1950 como las sucesivas ediciones con Mitchell Lewis como coautor se basaron en el curso de hematología para el London University Diploma of Clinical Pathology (DCP) y posteriormente en la licenciatura en Hematología en la entonces llamada Royal Postgraduate Medical School. La ciencia médica ha crecido de forma exponencial en el último medio siglo; sin embargo, ninguna disciplina se ha expandido más que la hematología, tanto en sus aspectos clínicos como de laboratorio. Inicialmente, la hematología de laboratorio se restringía casi al «recuento sanguíneo» con una cámara de recuento y un microscopio. El recuento sanguíneo sigue siendo una prueba esencial porque proporciona un componente importante para el diagnóstico y el tratamiento del paciente; sin embargo, los instrumentos automáticos actuales analizan las propiedades fisicoquímicas de las células sanguíneas individuales y ofrecen datos metrológicos precisos sobre los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas a una velocidad inimaginable en aquellos primeros tiempos. La sofisticada tecnología permite que los análisis más complejos sean realizados de forma rutinaria en muchos laboratorios; entre ellos se incluyen los estudios de ADN, el inmunofenotipado para la clasificación de las leucemias, el diagnóstico de las anemias megaloblásticas y las mediciones con radioisótopos. No obstante, tenemos que admitir que no todos los laboratorios disponen de las pruebas más sofisticadas y dedicamos un capítulo a las pruebas esenciales en los laboratorios con pocos recursos y en los centros de salud. También tenemos en cuenta el uso creciente de los dispositivos listos para su uso, comercialmente disponibles, para muchas pruebas de laboratorio, y la tendencia a la realización de algunas de estas pruebas en el punto de asistencia; aportamos sugerencias sobre el papel de soporte del laboratorio para garantizar la fiabilidad de esta última práctica. Otro avance de enorme impacto es Internet, mediante el cual se puede localizar cualquier tema, a menudo con una abrumadora cantidad de información, a partir de una sola palabra clave. Indicamos unos cuantos sitios de In-

ternet que son importantes para la hematología, incluyendo los de los fabricantes de dispositivos y reactivos especializados. Los científicos biomédicos son, cada vez más, los responsables del trabajo de laboratorio, de la misma forma que los hematólogos, médicamente cualificados, están más implicados en la asistencia clínica a los pacientes. Sin embargo, ambos grupos deben ser conscientes de la importancia de la organización y la dirección eficaz de un laboratorio, de la necesidad de mantener unos estándares técnicos elevados con controles de calidad bien establecidos y del conocimiento de la importancia clínica de las investigaciones hematológicas. Los principios de buena práctica de laboratorio los estableció Dacie en su 1.ª edición, cuando escribió: «Todos aquellos implicados en el trabajo de laboratorio deben comprender cuál es la importancia de las pruebas que realizan, el valor relativo de las investigaciones hematológicas y el orden en que deben emprenderse». Hemos intentado mantener su enfoque por lo que hace al contexto y al estilo, si bien actualizado para satisfacer la práctica actual. Deseamos expresar nuestro agradecimiento a todos nuestros colaboradores, y también a otros colegas que nos facilitaron consejo experto en temas específicos; entre ellos debemos mencionar especialmente a Michel Deenmamode (Radioisótopos), Mark Griffin (Salud y seguridad), Julia Howard (Citogenética), John Meek (Química clínica), Andrew Osei-Bimpong (Hematología general). Como especial homenaje con ocasión del 55 aniversario, esta edición está dedicada a Sir John Dacie, a sus estudiantes de diversos países, cuyas posteriores y distinguidas carreras se inspiraron en él, y al centro que él mismo fundó en la antigua Royal Postgraduate Medical School de la Universidad de Londres, actualmente Faculty of Medicine of Imperial College at Hammersmith Hospital. S. Mitchell Lewis Barbara J. Bain Imelda Bates

Sir John V Dacie, MD, FRCPath, FRS 1912–2005

Abreviaturas

ACD ácido citrato dextrosa AcMc, anticuerpo monoclonal AcMo ACRES sitio de amplificación creado por enzimas de restricción (del inglés, amplification created restriction enzyme site) ADA adenosindesaminasa ADE amplitud de la distribución eritrocitaria ADH amplitud de distribución de la hemoglobina ADN ácido desoxirribonucleico ADP adenosindifosfato AET 2-aminoetil-iso-tiouronio AHA anemia hemolítica autoinmunitaria ANAE alfa naftil acetato esterasa ANB alfa naftil butirato AP activador del plasminógeno APAAP fosfatasa alcalina anti-fosfatasa alcalina (del inglés, alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase) ARN ácido ribonucleico ASB albúmina de suero bovino ASOH hibridación de oligonucleótidos específicos de alelos (del inglés, allele-specific oligonucleotide hybridization) AT antitrombina ATP adenosintrifosfato BCSH Comité británico de normalización en hematología (del inglés, British Committee for Standards in Haematology) C complemento C3, C3d, componentes del complemento C3sg CAE naftol AS-D cloroacetato esterasa CD cúmulo de diferenciación CFA capacidad de fijación del anticuerpo CHAD enfermedad por hemoaglutinina fría (del inglés, cold haemagglutinin disease) CHCM concentración de hemoglobina corpuscular media Cp citoplasmático CPD citrato-fosfato-dextrosa CTP citosintrifosfato CV coeficiente de variación

DAB DE DMSO 2,3 DPG DTT EDTA EGIL

diaminobenzidina desviación estándar dimetilsulfóxido 2,3-difosfoglicerato ditiotreitol ácido etilendiaminotetraacético Grupo europeo para la clasificación inmunológica de las leucemias (del inglés, European Group for the Immunological Classification of Leukaemias) ELISA análisis de inmunoabsorción ligada a enzimas EN eritrocito nucleado ENE esterasa no específica ER enzima de restricción FAB francés-americano-británico (clasificación) FAG fosfatasa alcalina granulocítica FE ficoeritrina FSc dispersión de la luz hacia delante (del inglés, forward light scatter) FVL factor V de Leiden g gramos o fuerza centrífuga relativa, según contexto G6PD glucosa-6-fosfato deshidrogenasa GPI glucosilfosfatidilinositol Hb hemoglobina o concentración de hemoglobina HbCO carboxihemoglobina HCM hemoglobina corpuscular media HEMPAS multinuclearidad eritroblástica hereditaria con prueba del suero acidificado positiva (del inglés, hereditary erythroblastic multinuclearity with positive acidified-serum test) Hi metahemoglobina HiCN cianometahemoglobina HPF hemoglobinuria paroxística por frío HPLC cromatografía en fase líquida de alta resolución (del inglés, high performance liquid chromatography) HPN hemoglobinuria paroxística nocturna Hto hematocrito ICSH Comité internacional para la normalización en hematología (del inglés, International Council for Standardization in Haematology) IDR inmunodifusión radial

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

IEF

enfoque isoeléctrico (del inglés, isoelectric focusing) Ig inmunoglobulina IgA inmunoglobulina A IgD immunoglobulina D IgE immunoglobulina E IgG immunoglobulina G IgM immunoglobulina M IP immunoperoxidasa ITCF isotiocianato de fluoresceína kb kilobase LCP leucemia de células peludas LELV linfoma esplénico con linfocitos vellosos LISS medio salino de baja fuerza iónica (del inglés, low ionic strength saline) LLA leucemia linfoblástica aguda LLC leucemia linfática crónica LLC/PL leucemia linfática crónica con aumento de prolinfocitos LLTA leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto LMA leucemia mieloide aguda LMC leucemia mieloide crónica LPLB leucemia prolinfocítica de células B 2-ME 2-mercaptoetanol MESF moléculas de fluorocromo soluble equivalente MGG May-Grünwald-Giemsa MO médula ósea MPO mieloperoxidasa NEQAS evaluación externa de la calidad nacional (del inglés, national external quality assessment) NISS medio salino de fuerza iónica normal (del inglés, normal ionic strength saline) OMS Organización Mundial de la Salud p/v peso/volumen PAI prueba de antiglobulina indirecta PAS ácido peryódico de Schiff pb par de bases PBS medio salino tamponado con fosfato (del inglés, phosphate-buffered saline) PBSmedio salino tamponado con fosfato que azidacontiene azida sódica y albúmina de suero BSA bovino PCR reacción en cadena de la polimerasa PCR-TR reacción en cadena de la polimerasa de la transcriptasa reversa PDA prueba directa de antiglobulina PDF productos de degradación de la fibrina/fibrinógeno

PHHF pI PK PML POE PVP QSC RE RFLP RL RTCN RVH SDS SHb SMD SmIg SMRA SP SSc SSCP

TAE TBE TBS TCR TE TEB TP t-PA TR TT TTPA UI UIBC UV v/v VCM VIH vol VPM

persistencia hereditaria de la hemoglobina fetal punto isoeléctrico piruvatocinasa proteína codificada por el gen PML procedimiento operativo estándar polivinil pirrolidina quantum simply cellular recuento eritrocitario polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción recuento leucocitario recuento total de células nucleadas región hipervariable dodecil sulfato de sodio sulfahemoglobina síndrome o síndromes mielodisplásicos immunoglobulina de superficie (del inglés, surface immunoglobulin) sistema de mutación refractario a la amplificación sangre periférica dispersión de la luz lateral (del inglés, sideways light scatter) polimorfismo de conformación monocatenario (del inglés, single-strand conformation polymorphism) tris-acetato EDTA (tampón) tris-borato EDTA (tampón) salino tamponado con tris receptor del linfocito T tris–EDTA (tampón) tris-EDTA-borato (tampón) tiempo de protrombina activador del plasminógeno tisular transcriptasa reversa tiempo de trombina Tiempo de tromboplastina parcial activado unidades internacionales capacidad no saturada de fijación del hierro (del inglés, unsaturated iron-binding capacity) ultravioleta volumen/volumen volumen corpuscular medio virus de la inmunodeficiencia humana volumen volumen plaquetario medio

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NOTA Siguiendo las recomendaciones de la Organización Internacional de Estandarización (ISO), la Organización Mundial de la Salud (OMS) y otras autoridades internacionales, hemos utilizado el sistema internacional (SI) para expresar las cantidades y las unidades (v. págs. 592-593). La concentración de las soluciones se expresa en mol/l (para las concentraciones de las sustancias) o en g/l (para las concentraciones de la masa). Aunque somos conscientes de que en algunos países aún se utilizan los g/dl para expre-

sar la concentración de hemoglobina, hemos empleado g/l según la convención internacional. Para convertir esta cantidad en g/dl, basta con dividirla por 10. Hemos indicado la fuente de un reactivo, equipo o dispositivo en caso de que haya un único fabricante o cuando se recomienda una fabricación específica. Si no se indica la fuente, el material o el equipo adecuado estarán disponibles, por lo general, en diferentes suministradores. Los catálogos de estos fabricantes y la información detallada sobre el uso de sus equipos exclusivos pueden encontrarse en sus páginas web.

1 Recogida y manipulación de la sangre S. Mitchell Lewis y Noriyuki Tatsumi Precauciones ante el riesgo biológico Procedimiento estándar Sangre venosa Bandeja de flebotomía Sangre capilar Obtención de muestra de sangre capilar Preparación de la extensión sanguínea Diferencias entre sangre venosa y capilar

l investigar la función fisiológica y las disfunciones de la sangre, es esencial seguir una metodología precisa y exacta para garantizar, tanto como sea posible, que las pruebas no proporcionen una información falsa por causa de errores técnicos. La obtención de la muestra es el primer paso de los procedimientos analíticos. Es importante utilizar los contenedores sanguíneos adecuados y evitar los fallos en la recogida de la muestra, en su almacenamiento y en el transporte hasta el laboratorio. Generalmente se utiliza sangre venosa para la mayoría de los exámenes hematológicos y las pruebas químicas; las muestras obtenidas por punción capilar cutánea pueden ser igualmente satisfactorias para algunos fines, a condición de que se obtenga un flujo adecuado de sangre (v. pág. 3), pero, en general, este procedimiento debe reservarse para los niños y para determinadas pruebas de detección en el «centro de atención» que sólo requieran una o dos gotas de sangre. La aspiración de la médula ósea se describe en el capítulo 6.

A

Suero Anticoagulantes Efectos del almacenamiento sobre el recuento sanguíneo Efectos del almacenamiento sobre la morfología de las células sanguíneas Homogeneidad de la muestra

1 1 1 1 3 3 4 4

5 5 6 7 8

siempre en autoclave o en horno de aire caliente a 160 °C durante 1 h (v. pág. 556).

PROCEDIMIENTO ESTÁNDAR Los componentes de la sangre pueden alterarse debido a diversos factores, que se enumeran en la tabla 1.1. Es importante disponer de un procedimiento estándar para la recogida y la manipulación de las muestras sanguíneas. Se han publicado recomendaciones para la normalización de los procedimientos1-3.

SANGRE VENOSA Actualmente, lo habitual es que la recogida de muestras la realicen flebotomistas que han recibido una formación especial para ello, y existen directrices publicadas para establecer un programa de entrenamiento adecuado1,4.

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PRECAUCIONES ANTE EL RIESGO BIOLÓGICO Hay que prestar un cuidado especial para evitar el riesgo de infección por diversos patógenos durante todas las etapas realizadas en el laboratorio y seguir en lo posible los procedimientos de seguridad descritos en el capítulo 25 a la hora de extraer sangre. El operador debe utilizar guantes desechables de goma fina o de plásticoa. También es aconsejable la utilización de un delantal o de una bata protectora y, si es necesario, gafas o protectores oculares. Hay que tener cuidado para evitar las lesiones, sobre todo al manejar jeringas, agujas y lancetas. Si es posible, hay que utilizar jeringas, agujas y lancetas estériles desechables y no reutilizarlas nunca. Tras su utilización, los productos reutilizables se deben esterilizar

Bandeja de flebotomía Es conveniente disponer de una bandeja que contenga todo lo necesario para la obtención de la muestra de sangre (tabla 1.2).

Jeringas de plástico y agujas desechables Las agujas no deben ser demasiado finas, demasiado grandes o demasiado largas; las de 19 o de 21Gb son apropiaa

Algunos individuos pueden presentar una reacción alérgica tanto a los guantes de goma como a los de plástico (v. pág. 556). b La International Organization for Standardization ha establecido una norma (ISO 7864) que establece los diámetros siguientes para los distintos calibres: 19G = 1,1 mm; 21G = 0,8 mm; 23G = 0,6 mm.

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tabla 1.1. Causas de resultados falsos por discrepancias en la recogida de la muestra Antes de la recogida Haber ido al retrete en los 30 min anteriores; ingestión de agua o alimentos en las 2 h anteriores Fumar Actividad física (incluyendo el caminar rápidamente) en los 20 min anteriores Estrés Administración de fármacos o de suplementos dietéticos en las 8 h anteriores Durante la recogida Diferencias horarias (variación diurna) Postura: tumbado, de pie o sentado Hemoconcentración por mantenimiento prolongado de la presión del torniquete Exceso de presión negativa al aspirar la sangre en la jeringa Tipo de tubo incorrecto Sangre capilar en vez de sangre venosa Manejo de la muestra Anticoagulante insuficiente o en exceso Mezcla inadecuada de la sangre con el anticoagulante Error en la identificación del paciente y/o de la muestra Condiciones inadecuadas de almacenamiento de la muestra Retraso en el transporte al laboratorio

das para la mayoría de los adultos y las de 23G (sobre todo con una longitud de unos 15 mm) para los niños. Puede ser de utilidad extraer la sangre por medio de una aguja con alas («palomilla») insertada en un tubo de plástico de cierta longitud, que puede conectarse con la boquilla de la jeringa o con una aguja para atravesar el tapón de un tubo contenedor al vacío (v. más abajo la argumentación).

Contenedores de la muestra (tubos) Los contenedores corrientes para las pruebas hematológicas están disponibles comercialmente con anticoagulantes como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) dipotásico, tripotásico o disódico. Estos tubos tienen marcado un nivel que indica la cantidad correcta de sangre que hay que añadir. También existen contenedores que contienen citrato trisódico, heparina o citrato dextrosa, y contenedores sin aditivo, que se utilizan cuando se necesita suero. Los requisitos de diseño y otras características de los contenedores para la recogida de muestras están descritos en diversas normas nacionales e internacionales (p. ej., la del International Council for Standardization in Haematology5), y existe también una norma europea (EN 14820). Desgraciadamente, aún no se ha alcanzado un acuerdo universal relativo a los colores para identificar los contenedores con distintos aditivos; los flebotomistas deben familiarizarse con los colores utilizados por sus propios suministradores. Los sistemas de tubos al vacío, que son actualmente de uso corriente, consisten en un contenedor/tubo de vidrio o de plástico (con o sin anticoagulante) con un vacío definido, una aguja y un dispositivo portaagujas que fija la agu-

Tabla 1.2.

Bandeja de flebotomía

Jeringas y agujas Torniquete Contenedores para muestras (o sistema de tubos al vacío): simples y con diversos anticoagulantes Formulario de petición Torundas con alcohol isopropílico al 70% o con clorhexidina al 0,5% Compresas de gasa o almohadillas de celulosa estériles Apósitos adhesivos Bolsas de plástico autosellantes Gradillas para mantener las muestras verticales durante el proceso de llenado (También debe haber un contenedor desechable resistente a la punción)

ja al tubo. La principal ventaja radica en su tapón perforable, por lo que no es necesario retirarlo, ya sea para llenar el tubo o, posteriormente, para extraer las muestras para su análisis, minimizando de esta forma el riesgo de emisión en aerosol del contenido6,7. Un sistema al vacío es útil cuando se requieren múltiples muestras con distintos anticoagulantes. El vacío controla la cantidad de sangre que entra en el tubo, asegurando que la muestra sea la necesaria para las pruebas posteriores y para la proporción correcta de anticoagulante, cuando el tubo lo contiene. Los tubos al vacío recubiertos de silicona pueden utilizarse para las pruebas rutinarias de coagulación.

Procedimiento de la flebotomía El flebotomista debe comprobar en primer lugar la identidad del paciente, verificar que se corresponde con la detallada en el formulario de petición y asegurarse de que la bandeja de flebotomía tiene todos los contenedores de muestras necesarios. La sangre se extrae preferentemente de una vena antecubital o de otras venas visibles en el antebrazo por medio de un tubo al vacío o de una jeringa. Habitualmente, se recomienda que se limpie la piel con alcohol al 70% (p. ej., isopropanol) o con clorhexidina al 0,5% dejando que se seque por sí sola antes de la punción; sin embargo, han surgido ciertas dudas sobre la utilidad de esta práctica para evitar la infección en el sitio de venopunción8. También hay que tener cuidado al utilizar un torniquete para evitar que se contamine con la sangre, ya que se han notificado riesgos de infección durante la extracción de sangre9. El torniquete debe aplicarse inmediatamente por encima del sitio de venopunción y liberarse tan pronto como la sangre comienza a fluir en la jeringa o en el tubo al vacío; si se tarda demasiado en aflojarlo se producen alteraciones en el flujo y, como resultado de ello, hemoconcentración por estasis sanguínea en las venas4. Con práctica se debe poder obtener sangre venosa incluso de pacientes con venas difíciles (excepto en los niños muy pequeños). La aguja con palomilla tiene una utilidad especial cuando se necesitan varias muestras del mismo paciente. El éxito de la venopunción se facilita manteniendo caliente el brazo del sujeto, colocando en la parte superior del

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1 Recogida y manipulación de la sangre

brazo un manguito de esfigmomanómetro inflado con una presión similar a la presión diastólica y golpeando suavemente la piel, unas cuantas veces, sobre el sitio que se va a puncionar. Después de limpiar y secar la zona que se va a puncionar y aplicar el torniquete, se pide al paciente que apriete el puño varias veces. Por lo general, las venas adecuadas para la punción se hacen evidentes. Si las venas son muy pequeñas, la utilización de una aguja con palomilla o una de 23G debería permitirnos obtener de forma satisfactoria al menos 2 ml de sangre. En pacientes obesos, puede ser más fácil utilizar una vena del dorso de la mano, tras calentarla por inmersión en agua caliente; sin embargo, este sitio no se recomienda en general porque las punciones venosas en esta zona tienden a sangrar en los tejidos periféricos más fácilmente que en otros lugares. No se debe intentar una venopunción sobre una cicatriz o un hematoma. Si se utiliza una jeringa para la recogida de la sangre, hay que deslizar suavemente el pistón de la jeringa y no intentar extraer la sangre más deprisa que el propio llenado de la vena. Las muestras con anticoagulante se mezclan invirtiendo varias veces la posición de los contenedores. La hemólisis puede evitarse o minimizarse utilizando equipos limpios, extrayendo la sangre lentamente, no utilizando agujas demasiado finas, inyectando la sangre suavemente en el receptáculo y evitando que se forme espuma durante la extracción de la sangre y en el mezclado posterior con el anticoagulante. Si la sangre se extrae demasiado lentamente o se mezcla de forma inadecuada con el anticoagulante, se puede producir algún grado de coagulación. Tras la extracción, hay que tapar firmemente los contenedores para minimizar el riesgo de escapes. Si no se consigue extraer la sangre, es importante mantener la calma y considerar las causas posibles. Entre ellas se incluye la mala técnica, debida sobre todo a clavar en vez de mantener la aguja paralela a la superficie de la piel a medida que se introduce; así se puede traspasar la vena. Tras dos o tres intentos sin éxito, es preferible remitir al paciente a otro extractor tras un corto descanso. Después de extraer la sangre y aflojar el torniquete, se retira la aguja y se coloca una torunda estéril sobre el sitio de punción, aplicando presión en la torunda. Se debe elevar el brazo tras la extracción de la sangre y mantener la presión sobre la torunda con el brazo en alto durante unos cuantos minutos antes de comprobar que la hemorragia ha cesado por completo. Después se cubre el sitio de punción con un pequeño apósito adhesivo. La obtención de sangre a partir de un catéter implantado o de una vía de infusión es una fuente potencial de errores. Dado que la práctica habitual es enjuagar las vías con heparina, hay que limpiarlas de heparina antes de que se extraiga la sangre para las pruebas de laboratorio. Si se están transfundiendo líquidos intravenosos en un brazo, la muestra de sangre no debe recogerse de ese brazo.

Procedimiento posflebotomía De nuevo, el flebotomista debe comprobar la identidad del paciente y asegurarse de que se corresponde con la reseña-

da en el formulario de petición. Además de etiquetar el formulario de petición, es esencial que cada espécimen sea etiquetado con la identificación necesaria del paciente inmediatamente después de la obtención de las muestras. En las etiquetas se debe incluir al menos el apellido y el nombre o las iniciales, el número del hospital, la fecha de nacimiento y la fecha y el momento de la recogida de la muestra. La misma información debe aparecer en el formulario de petición, junto con el nombre del servicio o del departamento, el nombre del médico solicitante y las pruebas requeridas. Cuando sea pertinente, se debe pegar al contenedor y al formulario de petición un aviso de biopeligrosidad. Si se dispone de información automatizada del paciente, tanto la etiqueta como el formulario de petición deben tener un código de barras con los datos necesarios. Hay que enviar las muestras en bolsas de plástico individuales separadas de los formularios de petición para impedir la contaminación de los formularios en caso de escapes. Por otra parte, los tubos de las muestras se deben colocar derechos en las gradillas y deben transportarse junto con los formularios de petición hasta el laboratorio.

Eliminación de los desechos Sin separar la aguja de la jeringa, colocar ambas, junto con la torunda utilizada y cualquier otro apósito, en un contenedor resistente a la punción para desecharlos (v. página 558). Si no hay más remedio que eliminar la aguja de forma separada, hay que desprenderla de la jeringa únicamente con unas pinzas o con una herramienta similar. De forma alternativa, la aguja puede destruirse in situ con un aparato especial (p. ej., Sharp-X, Biomedical Disposal Inc., www.biodisposal.com).

SANGRE CAPILAR La punción cutánea se puede realizar para obtener una pequeña cantidad de sangre, ya sea para su utilización directa en un proceso analítico, o para su recogida en tubos capilares revestidos con heparina para la determinación del hematocrito o en un dispositivo especial de microrrecogida con anticoagulante (pág. 4). Estos métodos se utilizan principalmente cuando no es posible obtener sangre venosa (p. ej., en niños menores de 1 año de edad, en casos de una gran obesidad o en las pruebas sanguíneas realizadas a la cabecera del enfermo).

Obtención de muestra de sangre capilar La punción de la piel se realiza con una aguja o con una lanceta. En los adultos y en los niños mayores se puede obtener la sangre de un dedo; el sitio recomendado es la falange distal del tercer o cuarto dedo en su superficie palmar, entre 3 y 5 mm a partir del lecho ungueal. Anteriormente se utilizaba mucho el lóbulo auricular, pero actualmente su uso está desaconsejado, ya que el flujo sanguíneo que se obtiene a partir de él es tan reducido que no es representativo de la sangre circulante1. En los lactantes,

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

se pueden obtener muestras satisfactorias mediante una punción profunda de la superficie plantar del talón en el área mostrada en la figura 1.1. Como es preciso que el talón esté a una temperatura moderadamente elevada, puede ser necesario bañarlo en agua caliente. El área plantar central y la curvatura posterior no deben puncionarse en los lactantes pequeños para evitar el riesgo de lesión y la posible infección de los huesos del tarso subyacentes, sobre todo en los recién nacidos. En primer lugar, se debe limpiar el área con alcohol al 70% (p. ej., isopropanol) y se dejará que se seque. A continuación, se procederá a puncionar la piel hasta una profundidad de 2-3 mm con una lanceta estéril desechable. La primera gota de sangre se retirará con una gasa estéril seca. Si es necesario, puede apretarse muy suavemente para promover el flujo libre de sangre. Se recogerá luego la segunda y las siguientes gotas directamente en una tira reactiva o con una micropipeta de 10 o 20 ml y se introducirá la muestra inmediatamente en el diluyente. Es esencial que haya un flujo de sangre libre y sólo es aceptable realizar una compresión muy suave; idealmente, debe haber un exudado lento pero espontáneo de grandes gotas de sangre. Si hay que apretar con fuerza para obtener sangre, los resultados no son fiables. Si la escasez de flujo es consecuencia de que el sitio de punción está frío y cianótico, las cifras obtenidas de hemoglobina y del recuento de hematíes y de leucocitos son, por lo general, demasiado altas. Existen métodos para recoger la sangre en un tubo capilar fijado al tapón de un microcontenedor que permite que la sangre pase por acción capilar al interior del conte-

nedor (p. ej., Microtainerc)10. En otro sistema (Unopetted), un capilar calibrado se rellena completamente con sangre y se une con un volumen previamente medido de diluyente11. La punción adecuada, que origina un flujo libre de sangre, posibilita la recogida de un volumen mayor, gota a gota, en un contenedor de vidrio o de plástico12. Después de su utilización, las lancetas (y las agujas) deben colocarse en un contenedor resistente a la punción para la eliminación posterior de los desechos. No deben reutilizarse nunca en otro individuo.

Preparación de la extensión sanguínea De forma ideal, la extensión sanguínea debe realizarse inmediatamente después de la recogida de la sangre. Ya que las muestras sanguíneas son, por lo general, enviadas al laboratorio con un retraso variable, hay ciertas ventajas derivadas de preparar las extensiones sanguíneas cuando se lleva a cabo la flebotomía. La bandeja de flebotomía puede incluir algunos portaobjetos y cubreobjetos de cristal limpios y hay que proporcionar a los flebotomistas la formación adecuada para la preparación de la extensión, como se describe en el capítulo 4. También disponemos de un dispositivo automático para la realización de la extensión13. Cuando las extensiones no se hacen sobre la marcha, deben realizarse en el laboratorio sin demora, tan pronto como se reciban las muestras.

DIFERENCIAS ENTRE SANGRE VENOSA Y CAPILAR La sangre venosa y la sangre «capilar» no son exactamente lo mismo. La sangre de una punción cutánea es una mezcla de sangre procedente de arteriolas, venas y capilares y contiene algo de líquido intersticial e intracelular1,4,14. Aunque algunos estudios sugieren que las diferencias son insignificantes cuando se ha obtenido un flujo libre de sangre15, otros muestran diferencias definitivas en la composición de las muestras obtenidas por punción cutánea y la sangre venosa en neonatos16, niños17 y adultos18. Las diferencias pueden acentuarse con el frío, que se reflejaría en un flujo sanguíneo capilar más lento4. El hematocrito (Hto), el recuento de hematíes y la concentración de hemoglobina (Hb) de la sangre capilar son ligeramente mayores que los de la sangre venosa. Los recuentos totales de leucocitos y de neutrófilos son superiores en cerca de un 8%; el recuento de monocitos es superior en un 12% y en algunos casos hasta en un 100%, sobre todo en niños. En cambio, el recuento plaquetario parece ser mayor en la sangre venosa que en la capilar, siendo como media aproximadamente superior en un 9% y en algunos casos en hasta un 32%16-18. Este efecto puede ser el resultado de la adhesión de las plaquetas al sitio de punción cutánea.

Figura 1.1. Punción cutánea en lactantes. La punción debe restringirse a las partes exteriores medial y lateral de la superficie plantar del pie indicadas por la zona sombreada.

c d

BD Ltd. BD Ltd.

1 Recogida y manipulación de la sangre

SUERO La diferencia entre plasma y suero radica en que este último no contiene fibrinógeno ni algunos de los factores de coagulación. La sangre recogida para la obtención del suero debe guardarse en tubos estériles con tapones o en tubos de recogida al vacío simples (sin anticoagulantes) comercialmente disponibles, y dejar que coagule sin perturbaciones durante cerca de 1 h a temperatura ambientee. Después, hay que desprender suavemente el coágulo de las paredes del contenedor con ayuda de un bastoncillo de madera o de una varilla delgada de plástico o de cristal. El manejo brusco puede causar la lisis. Hay que cerrar el tubo con un tapón o capuchón. Algunos tubos contienen un activador de la coagulación junto con un gel para acelerar la separación del suero (p. ej., los tubos separadores de suerof). Los tubos, con o sin separador de suero, se centrifugan durante 10 min a aproximadamente 1.200 g. El suero sobrenadante es pipeteado en otro tubo y centrifugado de nuevo durante 10 min a aproximadamente 1.200 g. El suero sobrenadante se transfiere a los tubos para realizar las pruebas o para almacenarlo. En la mayoría de las pruebas, se debe mantener el suero a 4 °C hasta que se utilice, pero si se retrasa la prueba, se puede almacenar el suero a –20 °C hasta 3 meses y a –40 °C o menos para un almacenamiento a largo plazo. Las muestras congeladas deben descongelarse en el banco o en un baño de agua a temperatura ambiente; después deben invertirse varias veces para asegurar la homogeneidad antes de utilizarlas en una prueba. Las muestras descongeladas no se pueden volver a congelar.

con una pipeta Pasteur y se transfiere a un tubo que haya sido calentado por inmersión en un baño de agua. A continuación se centrifuga rápidamente para eliminar cualquier hematíe en suspensión.

ANTICOAGULANTES El EDTA y el citrato sódico eliminan el calcio, que es esencial para la coagulación. El calcio precipita como oxalato insoluble (cuyos cristales pueden verse en la sangre oxalatada) o se aglutina en una forma no ionizada. La heparina se une a la antitrombina, inhibiendo de esta forma la interacción de diversos factores de coagulación. El EDTA se utiliza para los recuentos sanguíneos; el citrato sódico para las pruebas de coagulación y la velocidad de sedimentación globular (VSG). Para una mejor conservación a largo plazo de los hematíes con vistas a la realización de determinadas pruebas y con fines de transfusión, se utiliza el citrato junto con la dextrosa en forma de ácido-citrato-dextrosa (ACD), citrato-fosfato-dextrosa (CPD) o solución de Alsever (v. pág. 587). Las mezclas de anticoagulantes se utilizan también para compensar las desventajas individuales de cada uno y para satisfacer las necesidades del proceso analítico19,20; estas mezclas son el ACD, el CPD o la heparina combinados con EDTA, y el EDTA, el citrato o a la heparina combinados con fluoruro sódico. Para realizar una citometría de flujo se puede utilizar cualquier anticoagulante en la recogida de sangre19,21.

Ácido etilendiaminotetraacético Desfibrinación de la sangre total El procedimiento descrito en el capítulo 28 (v. pág. 602) puede utilizarse para obtener hematíes libres de plasma, por ejemplo para investigar ciertos tipos de anemia hemolítica. Hay una buena preservación de la morfología celular en este proceso.

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Aglutininas frías Si hay que titular las aglutininas frías, se debe mantener la sangre a 37 °C hasta que se haya separado el suero. Si se sabe que hay aglutininas frías en concentraciones elevadas, lo mejor es traer al paciente al laboratorio y extraer la sangre con una jeringa previamente calentada para depositar después la sangre en contenedores que se hayan mantenido a 37 °C. Dichos contenedores, una vez rellenos, deben colocarse inmediatamente en un baño de agua caliente a 37 °C. De esta forma, se puede obtener un suero libre de hemoglobina, incluso en presencia de anticuerpos fríos capaces de producir aglutinación a temperaturas tan elevadas como 30 °C. Una forma práctica de calentar la jeringa es colocarla en su contenedor durante 10 min en un horno a aproximadamente 50 °C o durante 30 min en una incubadora a 37 °C. Cuando se retrae el coágulo de la muestra y se pone de manifiesto el suero claro, se extrae dicho suero e f

Generalmente, se considera temperatura ambiente entre 18 y 25 °C. BD Ltd.

Las sales de sodio y de potasio del EDTA son anticoagulantes potentes y están especialmente indicadas para los trabajos hematológicos de rutina. El EDTA actúa por medio de su efecto quelante sobre las moléculas de calcio de la sangre. Para conseguir la quelación se requiere una concentración de 1,2 mg de sal anhidra por ml de sangre (4 mmol). La sal dipotásica es muy soluble (1.650 g/l) y se utiliza con preferencia sobre la sal disódica, que es considerablemente menos soluble (108 g/l)22. El revestimiento de la superficie interna del tubo de recogida de la sangre con una capa delgada de EDTA mejora la velocidad de su captación por la sangre. La sal dilítica del EDTA es igualmente eficaz como anticoagulante23, y su utilización tiene la ventaja de que la misma muestra de sangre puede utilizarse para la investigación química. Sin embargo, es menos soluble que la sal dipotásica (160 g/l). El Clinical and Laboratory Standards Institute (anteriormente el National Committee for Clinical Laboratory Standards, o NCCLS) recomienda el uso en Estados Unidos de la sal tripotásica dispensada en forma líquida3. Sin embargo, la sangre añadida a esta solución estará ligeramente diluida y la sal tripotásica ocasiona un cierto encogimiento de los hematíes, lo que se traduce en un 2-3% de reducción en el Hto a las 4 h de la recogida, seguido por un incremento gradual en el volumen corpuscular medio (VCM). En cambio, estas modificaciones son insignificantes cuando se

5

6

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

utiliza la sal dipotásica1,4. En consecuencia, el International Council for Standardization in Haematology aconseja el uso de la sal dipotásica a una concentración de 1,50 ± 0,25 mg/ml de sangre24. El EDTA-Na3 no se recomienda debido a su pH elevado. El exceso de EDTA, independientemente de la sal utilizada, afecta tanto a los hematíes como a los leucocitos, produciendo su encogimiento y la aparición de cambios degenerativos. El EDTA por encima de los 2 mg/ml de sangre puede ocasionar una reducción significativa en el Hto por centrifugación y un aumento en la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM)4. Las plaquetas también se ven afectadas; el exceso de EDTA hace que se hinchen y se desintegren, lo que da lugar a un recuento plaquetario artificialmente elevado, porque los fragmentos son lo suficientemente grandes para ser considerados como plaquetas normales. Por tanto, hay que asegurarse de que la cantidad de sangre añadida sea la correcta y de que, por medio de inversiones repetidas del contenedor, el anticoagulante se mezcle completamente con la sangre que se le añade. Es posible que en las extensiones sanguíneas realizadas a partir de sangre con EDTA no puedan observarse los punteados basófilos de los hematíes en la intoxicación con plomo. También se ha demostrado que el EDTA produce una leucoaglutinación que afecta tanto a los neutrófilos como a los linfocitos25, y es responsable de la actividad de un autoanticuerpo antiplaquetario que aparece de forma natural y que puede, en ocasiones, causar la adherencia de las plaquetas a los neutrófilos en las extensiones sanguíneas (v. pág. 97). Se ha observado que la activación de los monocitos, medida por la liberación del factor tisular y por la actividad del factor de necrosis tumoral, es menor con el EDTA que con el citrato y la heparina. De forma similar, la activación de los neutrófilos medida por la liberación de la lactoferrina inducida por los lipopolisacáridos es menor con el EDTA. Parece que el EDTA también suprime la degranulación plaquetaria26.

Citrato trisódico En los estudios de coagulación se añaden 9 volúmenes de sangre a 1 volumen de una solución de citrato sódico de 109 mmol/l (32 g/l de Na3C6H5O7.2H2Og)27. Esta proporción de anticoagulante y sangre es fundamental, ya que los efectos osmóticos y los cambios en la concentración del ion calcio libre afectan a los resultados de las pruebas de coagulación. Para determinar la VSG, se añaden 4 volúmenes de sangre a 1 volumen de la solución de citrato sódico (109 mmol/l) mezclándose inmediatamente de forma adecuada. La mezcla se introduce en un tubo Westergren28.

Heparina Las sales de litio o de sodio de la heparina a una concentración de 10-20 UI por ml de sangre son un anticoagulante corrientemente utilizado para las pruebas bioquímicas,

g

O 38 g/l de 2Na3C6H5O7. 11 H2O.

las determinaciones de urgencia y las gasometrías. No alteran el tamaño de los hematíes y su uso está recomendado en las situaciones en que es importante reducir al mínimo la posibilidad de lisis después de la extracción de la sangre. Es, por tanto, el mejor anticoagulante para las pruebas de fragilidad osmótica y es apropiada para el inmunofenotipado. Sin embargo, la heparina no es adecuada para realizar los recuentos sanguíneos porque a menudo induce la formación de agregados de plaquetas y de leucocitos4,29,30. Tampoco debe utilizarse para la realización de extensiones sanguíneas porque da una débil coloración azul de fondo cuando las extensiones se tiñen con la tinción de Romanowsky, sobre todo en presencia de proteínas anormales. Inhibe la actividad enzimática19 y no debe utilizarse en el estudio de la reacción en cadena por la polimerasa con enzimas de restricción31.

EFECTOS DEL ALMACENAMIENTO SOBRE EL RECUENTO SANGUÍNEO Cuando se almacena la sangre con anticoagulantes a temperatura ambiente se producen diversos cambios; éstos son más rápidos cuanto más elevada es dicha temperatura. Se originan independientemente del anticoagulante, aunque son menos marcados en la sangre con ACD, CPD o solución de Alsever que en la sangre con EDTA, y mayores con la sal tripotásica de EDTA que con la dipotásica. Los recuentos de hematíes, de leucocitos y de plaquetas y los índices eritrocitarios permanecen habitualmente estables durante 8 h tras la recogida de sangre, aunque, a medida que los hematíes comienzan a hincharse, el Hto y el VCM se incrementan, aumenta la fragilidad osmótica y disminuye la VSG. Cuando la sangre se mantiene a 4 °C, los efectos en el recuento sanguíneo son, por lo general, insignificantes hasta las 24 h. Por tanto, para muchas determinaciones, se puede conservar la sangre de forma segura durante la noche en el refrigerador si se toman precauciones para que no se congele. Sin embargo, es preferible hacer el recuento de leucocitos y sobre todo de plaquetas a las 2 h, y hay que señalar que la reducción en el recuento leucocitario y la reducción progresiva en el recuento linfocitario absoluto pueden ser muy notables a las pocas horas, sobre todo si hay una cantidad excesiva de EDTA (>4,5 mg/ml)21. El almacenamiento más allá de 24 h a 4 °C produce datos falsos en los recuentos diferenciales automatizados de leucocitos, aunque la magnitud de las variaciones depende de las prestaciones del instrumento y de las recomendaciones del fabricante, que deben seguirse cuando se utiliza un método automático de recuento. Un estudio, en el que se utilizó un analizador de apertura-impedancia para el análisis de sangre dejada a temperatura ambiente, mostró que el recuento de leucocitos y de neutrófilos permanecía estable durante 2-3 días, pero el resto de los leucocitos sólo permanecieron estables durante unas pocas horas32. Los recuentos reticulocitarios no se modifican cuando la sangre se mantiene con un anticoagulante, ya sea EDTA o

1 Recogida y manipulación de la sangre

ACD, durante 24 h a 4 °C, pero a temperatura ambiente el recuento comienza a disminuir a las 6 h. Los hematíes nucleados desaparecen de la muestra sanguínea en 1-2 días a temperatura ambiente. La concentración de hemoglobina se mantiene sin cambios durante días, siempre y cuando la sangre no se infecte, lo que se pondría de manifiesto por la turbidez o decoloración de la muestra. Sin embargo, en 2-3 días y sobre todo a alta temperatura ambiente, la sangre comienza a lisarse, lo que da como resultado una disminución en los recuentos de hematíes y en el Hto, con un aumento de la HCM y de la CHCM. La estabilidad de las pruebas de coagulación es fundamental para el diagnóstico y el tratamiento de las coagulopatías. El NCCLS recomienda que las pruebas se lleven a cabo a las 2 h cuando la sangre o el plasma se han almacenado a 22-24 °C, a las 4 h a 4 °C, a las 2 semanas a –20 °C y a los 6 meses a –70 °C2. Para las pruebas en plasma o suero, la sangre debe centrifugarse dentro de un plazo de 5 h tras la recogida. Para los análisis de vitamina B12 y folato, se debe mantener el suero o el plasma a 4 °C o a –20 °C si se requiere un almacenamiento superior a las 2-3 semanas. En el almacenamiento a largo plazo, hay que dividir las muestras en varias alícuotas para evitar las congelaciones y descongelaciones repetidas. El manejo inapropiado de las muestras sanguíneas durante el transporte al laboratorio (p. ej., la agitación excesiva) puede causar hemólisis, coagulación parcial y desintegración celular. El envío de las muestras necesita un empaquetado especial.

EFECTOS DEL ALMACENAMIENTO SOBRE LA MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS

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Los cambios en la morfología de las células sanguíneas se producen fácilmente, incluso en el almacenamiento a cor-

to plazo. Estos cambios no son únicamente el resultado de la presencia de un anticoagulante, ya que pueden ocurrir también en la sangre desfibrinada. Independientemente del anticoagulante, las extensiones hechas con sangre que ha permanecido durante menos de 1 h a temperatura ambiente no se distinguen fácilmente de las realizadas tras la recogida de la sangre. A las 3 h, se pueden discernir los cambios y a las 12-18 h son muy llamativos. Hay afectación de algunos, aunque no de todos, los neutrófilos; sus núcleos pueden teñirse de forma más homogénea que en la sangre fresca, los lóbulos nucleares pueden separarse y el borde citoplasmático presentarse deshilachado o menos definido; pequeñas vacuolas aparecen en el citoplasma (fig. 1.2A y B). Algunos o muchos de los monocitos grandes desarrollan cambios notables; aparecen pequeñas vacuolas en el citoplasma y el núcleo sufre una lobulación irregular, que puede llegar casi a la desintegración (fig. 1.2C). Los linfocitos sufren cambios similares: en el citoplasma pueden observarse algunas vacuolas, los núcleos se tiñen de forma más homogénea de lo habitual y, en algunos, los núcleos sufren una lobulación (dando lugar a núcleos con dos o tres lóbulos) (fig. 1.2D–F). Los hematíes normales resultan poco afectados por permanecer hasta 6 h a temperatura ambiente. Los períodos superiores producen una progresiva espiculación (crenación) y formación de esferocitos (fig. 1.2B, E y F). El exceso de EDTA origina un grado notable de espiculación a las pocas horas. Todos los cambios previamente mencionados están retardados, aunque no abolidos, en la sangre que se mantiene a 4 °C. Su aparición subraya la importancia de hacer las extensiones tan pronto como sea posible tras la recogida de la sangre. No obstante, como norma, es aceptable un retraso de hasta 3 h. Estas modificaciones producidas por la aparición de artefactos deben distinguirse de la apoptosis, que es un proceso controlado de muerte celular programada que se produce cuando las citocinas y los factores de crecimiento que regulan la supervivencia celular están deplecionados

C

Figura 1.2. Efectos del almacenamiento sobre la morfología de las células sanguíneas. Microfotografías de extensiones realizadas con sangre y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) tras 24 h a 20 °C. A y B, neutrófilos polimorfonucleares; C, monocitos; D, E y F, linfocitos. La espiculación (crenación) de los hematíes es apreciable en B y E.

E

A

B

D

F

7

8

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Figura 1.3. Características morfológicas de la apoptosis.

o inhibidos, siendo la disfunción mitocondrial el evento clave33,34. La apoptosis se caracteriza morfológicamente (fig. 1.3) por encogimiento celular con condensación citoplasmática alrededor de la membrana nuclear e indentaciones en el núcleo, seguido de su fragmentación; por último, los restos celulares forman unas masas basófilas extensas (los cuerpos apoptósicos). Los neutrófilos en apoptosis con un único cuerpo apoptósico pueden confundirse con los hematíes nucleados si no se valoran las características citoplasmáticas. Los restos celulares se eliminan de la circulación por fagocitosis y, habitualmente, en las extensiones sólo se observa una célula apoptósica ocasional rodeada de células normales35. Las células apoptósicas pueden verse con mayor frecuencia en las leucemias.

HOMOGENEIDAD DE LA MUESTRA Para asegurar la dispersión uniforme de las células sanguíneas, es esencial que los especímenes se mezclen de forma eficaz inmediatamente antes de tomar una muestra para la prueba. Colocar el tubo de la muestra en un mezclador por rotación mecánica durante al menos 2 min o invertir el tubo manualmente unas 8-10 veces. Si la muestra ha sido almacenada a 4 °C, estará viscosa y hay que dejar que la sangre se caliente a temperatura ambiente antes de mezclarla.

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1 Recogida y manipulación de la sangre

23.

24.

25.

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2 Intervalos de referencia y valores normales S. Mitchell Lewis Intervalos de referencia Procedimientos estadísticos Límites de confianza Valores normales de referencia Variaciones fisiológicas en el recuento sanguíneo

iertos factores afectan a los valores hematológicos en los individuos aparentemente sanos. Como se ha descrito en el capítulo 1, entre ellos se encuentran la técnica y el momento de la recogida sanguínea, el transporte y el almacenamiento de las muestras, las diferencias en la posición del sujeto a la hora de tomar la muestra, la actividad física previa o si el sujeto está confinado en su cama. Las variaciones en los métodos analíticos utilizados también pueden afectar a las mediciones. Todo esto puede estandarizarse. Más problemáticas son las variables inherentes al sexo, la edad, la ocupación, la constitución corporal, la herencia genética y la adaptación a la dieta y al entorno (sobre todo a la altitud). Todos estos factores deben tenerse en cuenta cuando se establecen los valores fisiológicos normales. Además, en cualquier investigación poblacional realizada para obtener datos a partir de los cuales se puedan construir los rangos de normalidad, es difícil asegurar que los sujetos «normales» están completamente sanos y no tienen deficiencias nutricionales (sobre todo deficiencia de hierro, que es prevalente en muchos países), infecciones crónicas leves, infestaciones parasitarias ni presentan los efectos del tabaquismo. Los valores hematológicos normales y anómalos se solapan, y un valor dentro del rango admitido como normal puede ser definitivamente patológico en un sujeto en particular. Por todas estas razones, el concepto de «valores normales» y «rangos normales» ha sido sustituido por el de valores de referencia y rango de referencia, que se definen por los límites de referencia y se obtienen por las mediciones en la población de referencia de una prueba en particular. El rango de referencia se denomina también intervalo de referencia1,2. De forma ideal, cada laboratorio debe establecer un banco de datos de valores de referencia que tengan en cuenta las variables mencionadas más arriba, de forma que los resultados de un individuo puedan expresar-

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C

11 11 12 13

Componentes de los eritrocitos Cambios transitorios Recuento leucocitario Recuento plaquetario Otros componentes sanguíneos

16 17 18 19 19

16

se e interpretarse en relación con una población comparable, aparentemente normal, en la medida en que puede definirse lo que es normal y lo que no.

INTERVALOS DE REFERENCIA Se puede establecer un intervalo de referencia para una población determinada a partir de las mediciones de un número relativamente pequeño de sujetos (se analizará más adelante), si se asume que son representativos de la población en su totalidad2. Hay que estandarizar las condiciones para la obtención de muestras de los individuos y los procedimientos analíticos, y analizar los datos de forma separada según las diferentes variables, tales como los individuos encamados o ambulatorios, los fumadores o no fumadores, y así sucesivamente. Las muestras se recogerán aproximadamente a la misma hora del día, con preferencia por la mañana antes del desayuno, sin haber ingerido comida después de las 9 p.m. de la noche anterior y habiendo restringido el consumo de alcohol a una botella de cerveza o una cantidad equivalente de otra bebida alcohólica en este mismo período de tiempo3.

PROCEDIMIENTOS ESTADÍSTICOS En las mediciones biológicas, se asume habitualmente que los datos encajarán en un patrón especificado, ya sea simétrico (Gaussiano) o asimétrico con una distribución sesgada (no Gaussiano). En una distribución Gaussiana, la media aritmética (χ– ) puede obtenerse dividiendo la suma de todas las mediciones por el número de observaciones. La moda es el valor que se presenta con más frecuencia y la mediana (m) es el punto en el que hay el mismo número de observaciones por encima y por debajo de él. En una dis11

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

24

20

16

12

8

4

0 100

120 –3

–2

140 –1

180 Hb g/l

160

0

+1

+2

+3

DE

tribución Gaussiana real todos estos parámetros deberían ser iguales. La desviación estándar (DE) puede calcularse según se describe en la página 587. Si los datos siguen una distribución Gaussiana, cuando se representan en un histograma de frecuencia se obtiene el patrón que se muestra en la figura 2.1. Tomando la moda y la DE como puntos de referencia, se ha superpuesto una curva de Gauss sobre el histograma. A partir esta curva, se pueden determinar los límites prácticos de referencia incluso si el histograma original incluye algunos resultados extremos de sujetos que no pertenecen a la población normal. Los límites que representan el intervalo de referencia del 95% se calculan a partir de la media aritmética ±2 DE (o de forma más precisa, ±1,96 DE). Cuando hay una distribución logarítmica normal (asimétrica) de las mediciones, el intervalo hasta –2 DE puede incluso extenderse hasta el cero (fig. 2.2A). Para evitar esta anomalía, se representan los datos en un papel de gráfico semilogarítmico para obtener un histograma con distribución normal (fig. 2.2B). Para calcular la media y la DE hay que convertir los datos en sus logaritmos por medio de una calculadora con la función apropiada. El valor logarítmico

Intervalo: media 2 DE 15

15

10

10

5

0 0

200 400 600 B12 en suero (pg/ml) Escala lineal

Figura 2.1. Ejemplos del establecimiento de un intervalo de referencia. Histograma de los datos relativos a las mediciones de hemoglobina en una población, con una curva de Gauss sobrepuesta. Las ordenadas muestran la cantidad encontrada en cada punto de referencia. La media fue de 140 g/l; se indican los intervalos de referencia en 1 DE, 2 DE y 3 DE.

medio se obtiene sumando los logaritmos de todas las mediciones y dividiendo la suma por el número de observaciones. El logaritmo de la DE se calcula con la fórmula de la página 587 y los resultados se convierten en sus antilogaritmos para expresar los datos en la escala aritmética. Este proceso se puede realizar también en un ordenador con un programa estadístico apropiado. Cuando no es posible hacer una suposición sobre el tipo de distribución, se puede utilizar un procedimiento no paramétrico en su lugar para obtener la mediana y la DE. Con este fin, se clasifican los datos y se ordenan de menor a mayor según sus valores cuantitativos, y después se calcula la mediana como se muestra en la tabla 2.1. Para obtener una aproximación de la DE, se lee y se divide por 1,35 el intervalo que comprende el 50% central de la distribución (es decir, entre el 25 y el 75% de los resultados). Este valor representa 1 DE4.

Límites de confianza Con cualquiera de los métodos de análisis, se puede obtener una estimación razonablemente fiable con 40 valores, aun-

Intervalo: media 2 DE

Frecuencia

Frecuencia

12

800

5

0 100

200 400 600 900 B12 en suero (pg/ml) Escala logarítmica

Figura 2.2. Ejemplos de conversión a una distribución logarítmica normal. Datos de las mediciones de vitamina B12 en una población. A: Escala aritmética: Media 340; intervalo 2 DE calculado como 10-665 pg/ml. B: Escala geométrica: Media 308; intervalo 2 DE calculado como 120–780 pg/ml.

2 Intervalos de referencia y valores normales

Tabla 2.1.

Ilustración del cálculo de la medianaa

N.º de rango

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Hemoglobina g/l

110

112

113

115

115

118

120

122

124

126

127

Si el total (n) es un número impar, la posición de la mediana en el rango se calcula mediante

(n+1) (es decir, posición 6 = 118 g/l) 2

N.º de rango

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Hemoglobina g/l

110

112

113

115

115

118

120

122

124

126

Si el total (n) es un número par, la posición de la mediana en el rango está entre 5 y 6 del rango =

n (n+2) y (es decir, entre las posiciones 2 2

(115+118) = 116,5 g/l) 2

a

En la práctica se requeriría un número mayor para que la estadística fuera significativa (v. texto).

que es preferible un número mayor (120 o más) (fig. 2.3)5. Cuando no se puede disponer de un conjunto grande de valores de referencia y no es posible hacer un cálculo preciso, podemos también utilizar un número más pequeño de valores como guía clínica útil. Los límites de confianza definen la fiabilidad (p. ej., 95 o 99%) de los valores de referencia establecidos para evaluar si los resultados de una prueba son significativos, sobre todo cuando éstos se sitúan en la línea que separa lo normal y lo anómalo. El cálculo de los límites de confianza se describe en la página 587. Otra medición importante es el coeficiente de variación (CV) de la prueba, porque es muy probable que un CV amplio influya en su utilidad clínica (v. pág. 538).

Los datos se han obtenido de observaciones personales, así como de publicaciones diversas6-11. Sin embargo, se pueden encontrar intervalos ligeramente diferentes en laboratorios individuales que utilicen distintos analizadores y métodos. El intervalo de referencia, que comprende un rango de ±2 DE a partir de la media, indica los límites que deberían abarcar al 95% de los sujetos normales; el 99% de dichos sujetos estarían incluidos en el rango de ±3 DE. En algunos valores se han tenido en consideración las diferencias de edad y de sexo. Incluso así, los amplios intervalos mostrados en varias pruebas reflejan la influencia de diversos factores, como se describe más abajo. En condiciones estandarizadas, cabría esperar unos intervalos más estrechos. Dado el alto nivel de precisión técnica proporcionado por los analizadores modernos, incluso las pequeñas diferencias en las mediciones sucesivas pueden ser significativas. Por lo tanto, es importante establecer y comprender los límites de las variaciones fisiológicas de las diversas pruebas. Los datos del recuento sanguíneo y los resultados de otras pruebas pueden proporcionar indicaciones sensibles de pequeñas anomalías que pueden tener su importancia

VALORES NORMALES DE REFERENCIA

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Los datos mostrados en las tablas 2.2, 2.3 y 2.4 proporcionan una guía general de los valores de referencia normales que pueden aplicarse a la mayoría de los adultos y niños sanos, respectivamente, en los países industrializados.

Figura 2.3. Efecto del tamaño de la muestra en los valores de referencia. Se obtuvo un gráfico de una distribución suavizada de las mediciones de hemoglobina en un grupo de mujeres normales; las ordenadas muestran la distribución de la frecuencia. El intervalo de referencia del 95% está definido por los límites de referencia inferior y superior, que son 115 y 165 g/l, respectivamente. Los niveles de confianza de estos valores se muestran para tres tamaños de muestra con valores de 20, 40 y 165, respectivamente.

0,95

60

70

80

90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 n = 165 n = 40 n = 20

g/l

13

14

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tabla 2.2.

Valores hematológicos para adultos normales expresados como la media ±2 DE (rango del 95%)

Recuento de eritrocitos Hombres Mujeres

5,0 ± 0,5 × 1012/l 4,3 ± 0,5 × 1012/l

Hemoglobina Hombres Mujeres

150 ± 20 g/l 135 ± 15 g/l

Hematocrito (Hto) Hombres Mujeres

0,45 ± 0,05 (l/l) 0,41 ± 0,05 (l/l)

Volumen corpuscular medio (VCM) Hombres y mujeres

92 ± 9 fl

Hemoglobina corpuscular media (HCM) Hombres y mujeres 29,5 ± 2,5 pg Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) Hombres y mujeres 330 ± 15 g/l Amplitud de distribución eritrocitaria (ADE) Como coeficiente de variación (CV) 12,8 ± 1,2% Como desviación estándar (DE) 42,8 ± 3,5 fl

Determinación del fibrinógeno

≥128

Plasminógeno

0,75–1,60 u/ml

Tiempo de lisis de euglobulina

90–240 min

Antitrombina

0,75–1,25 u/ml

β-Tromboglobulina

A1 > A1B. Ocasionalmente se encuentran otros subgrupos de A (p. ej., A3 y Ax) que resultan de formas mutantes de las glucosiltransferasas producidas por el gen A y son menos eficientes para transferir N-acetil-D-galactosamina a la sustancia H7. Los antígenos A, B y H son detectables precozmente en la vida fetal, pero al nacimiento no están completamente desarrollados en los eritrocitos. El número de sitios antigénicos alcanza los niveles «adultos» alrededor del año de edad y se mantiene constante hasta la vejez, cuando puede ocurrir una ligera reducción.

Gen

Producto génico

H

A

B

O

Enzima glucosiltransferasa específica

X Sustrato aceptor

Determinante antigénico

Cadena de oligosacáridos

H

Sustancia H

A

B

Figura 19.1. Rutas genéticas del grupo sanguíneo HAB a antígenos. *Glucosiltransferasa H transfiere a L-fucosa; A transfiere a N-acetil-D-galactosamina; B transfiere a D-galactosa; O es inactivo.

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

Secretores y no secretores La capacidad de secretar sustancia A, B y H en forma hidrosoluble está controlada por FUT2 (alelo dominante Se). En una población caucásica, alrededor del 80% son secretores (genotipo SeSe o Sese) y el 20% son no secretores (genotipo sese) (tabla 19.6). Los secretores tienen sustancia H en la saliva y otros fluidos corporales junto con sustancias A, B o ambas, dependiendo de su grupo sanguíneo. En las secreciones de los no secretores sólo existen trazas de estas sustancias, aunque los antígenos se expresan normalmente en sus eritrocitos y otros tejidos. El estatus individual de secretor puede ser determinado por análisis de la sustancia ABH en la saliva (v. pág. 434).

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Antígenos ABO y enfermedad Los individuos del grupo A pueden adquirir en raras ocasiones un antígeno B de una infección bacteriana que produce la liberación de una enzima desacetilasa. Ésta convierte la N-acetil-D-galactosamina en α-galactosamina, que es similar a la galactosa, el azúcar inmunodominante del grupo B, lo que causa, algunas veces, que los eritrocitos parezcan del grupo AB. En los casos de que se informó originalmente, cinco de los siete pacientes tenían un carcinoma del tracto gastrointestinal. Los informes de casos atestiguan sobre el peligro de transfundir con eritrocitos AB a individuos con un antígeno B adquirido, lo que resulta en una reacción transfusional hemolítica fatal, debida a la producción de anti-B hiperinmune8. Se sabe también que la herencia de antígenos ABH se asocia débilmente con la predisposición a ciertas enfermedades. Los individuos del grupo A tienen 1,2 veces más riesgo de desarrollar carcinoma gástrico que los del grupo O o B; los individuos del grupo O tienen 1,4 veces más riesgo de desarrollar úlcera péptica que los individuos que no son del grupo O; y los no secretores de ABH tienen 1,5 veces más riesgo de desarrollar úlcera péptica que los secretores9. El grupo ABO también afecta al factor plasmático de Von Willebrand (FVW) y a los niveles de factor VIII; los individuos sanos del grupo O tienen niveles alrededor de un 25% menores que los otros grupos ABO10. Se ha demostrado que la expresión del antígeno H (que es mayor en los individuos del grupo O) es la que media este efecto, y podría ser debido a aclaramiento acelerado del FVW a través de un mecanismo mediado por fucosa11. También en las personas con leucemia, con frecuencia, los antígenos ABO se expresan más débilmente en los eritrocitos.

Anticuerpos ABO Anti-A y anti-B Los anticuerpos ABO, en ausencia de los correspondientes antígenos, aparecen durante los primeros meses tras el nacimiento, probablemente como resultado de exposición a sustancias similares a los antígenos ABH en la dieta o en el ambiente (es decir, «ocurren naturalmente») (v. tabla 19.4). Esto permite la determinación indirecta del grupo (suero/plasma) como un medio de confirmar el fenotipo de los eritrocitos. Los anticuerpos son una causa potencial de reacción

Tabla 19.6. Genes

Estado secretor en la población caucásica

Grupo sanguíneo de los eritrocitos

Secretor SeSe A Sese AB No-secretores sese A, B, AB o O

Sustancia ABH presente en la saliva

Incidencia (%)

A+HoB A+B+H O

B+H 80 H

Ninguna

20

transfusional hemolítica peligrosa, si se administran transfusiones sin considerar la compatibilidad ABO. Los anti-A y anti-B son casi siempre inmunoglobulinas M (IgM). Aunque éstas reaccionan mejor a baja temperatura, sin embargo, son potencialmente líticas a 37 °C. Los anti-A y anti-B hiperinmunes ocurren con menor frecuencia, generalmente como respuesta a una transfusión o a un embarazo, pero podrían también formarse tras inyección de algunos toxoides o vacunas. Estos anticuerpos son predominantemente de clase IgG y son generalmente producidos por el grupo O y a veces por individuos del grupo A2. La IgG hiperinmune anti-A y/o anti-B de las madres con grupo O o A2 pueden cruzar la placenta y causar enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN). Estos anticuerpos reaccionan con un amplio intervalo de temperaturas y producen hemólisis más eficazmente que los anticuerpos naturales. Los donantes del grupo O deberían también ser evaluados por si presentan anticuerpos hiperinmunes anti-A y anti-B, que pueden causar hemólisis cuando se transfundan plaquetas del grupo O o sangre completa a receptores con fenotipos A y B. Los hemoderivados que contengan plasma de donante universal peligroso (título elevado) deben reservarse para receptores de grupo 0.

Anti-A1 y anti-H Los anti-A1 reaccionan sólo con células A1 y A1B y se encuentran ocasionalmente en el suero de individuos del grupo A2 (1-8%) y no infrecuentemente en el suero de sujetos A2B (25-50%). Sin embargo, los anti-A1 normalmente actúan como una aglutinina fría y muy raramente son reactivos a 37 °C, siendo sólo capaces de una limitada destrucción de los eritrocitos. Existen pocos informes de hemólisis de eritrocitos atribuida a anti-A1, que algunos autores han cuestionado, porque aunque los anticuerpos reaccionaban sólo con eritrocitos A1, no se intentó absorberlos con células A2, lo que habría revelado su especificidad anti-A. Los anti-H reaccionan con más fuerza con los eritrocitos del grupo O y A2 y normalmente actúan también como aglutininas frías. Una notable, pero rara excepción, es el anti-H que se produce en el fenotipo Oh Bombay, que es un anticuerpo IgM que causa lisis a 37 °C (v. tabla 19.4), por lo que para ser transfundido requeriría sangre con fenotipo Oh Bombay.

417

418

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Sistema Lewis Antígenos Lewis y genes codificadores Los antígenos Lewis (Lea y Leb) se localizan en los glucoesfingolípidos solubles presentes en la saliva y el plasma y son secundariamente absorbidos al interior de la membrana del glóbulo rojo desde el plasma. El gen Le en el locus FUT3 (LE) está localizado en el cromosoma 19 y codifica para una fucosiltransferasa, que actúa sobre una molécula de azúcar adyacente para que actúe mediante el gen Se. Cuando Se y Le están presentes, se produce el antígeno Leb; cuando está presente Le, pero no Se, se produce Lea; y cuando no está presente Le, no se producen ni Lea ni Leb. Después de una transfusión de eritrocitos, los eritrocitos del donante se convertirán al tipo Lewis del receptor a causa del continuo intercambio de glucoesfingolípidos entre el plasma y la membrana de los eritrocitos. Los neonatos tienen el fenotipo Le (a–b–), porque en los primeros 2 meses de vida se producen bajos niveles de fucosiltransferasa.

Anticuerpos Lewis Los anticuerpos Lewis se producen de forma natural; normalmente son IgM y fijan el complemento. In vitro, su reactividad se potencia por el uso de eritrocitos tratados con enzimas, pudiendo producir lisis. Sin embargo, sólo excepcionales ejemplos de anti-Lea, estrictamente reactivos a 37 °C, producen reacciones transfusionales hemolíticas y no existen claras evidencias de que los anti-Leb hayan causado alguna vez un episodio hemolítico. Las explicaciones para la relativa ausencia de significado clínico incluyen su amplitud térmica, la neutralización por los antígenos Lewis en el plasma de la sangre transfundida y la gradual elución de los antígenos Lewis por los eritrocitos del donante. Por tanto, es aceptable suministrar eritrocitos para transfusiones, que no hayan sido tipados como negativos para el antígeno Lewis relevante, pero que son compatibles con el plasma del receptor cuando se realizan las pruebas de compatibilidad estrictamente a 37 °C. No se han observado casos en los que los anticuerpos Lewis hayan provocado enfermedades hemolíticas del feto o recién nacido. La influencia del grupo Lewis en el resultado del trasplante renal es incierta.

Sistema P y colección de globósidos Antígenos El antígeno P1 del sistema P y los antígenos P y Pk de la colección de globósidos están relacionados. Se conoce poco sobre los genes implicados o sus productos, pero todos derivan del precursor lactosil ceramida. Los carbohidratos relacionados con el sistema P están ampliamente distribuidos en la naturaleza. La expresión de P1 varía considerablemente entre individuos. Uno de cada 100.000 individuos es p (negativo para P) y es resistente a infección por parvovirus B19.

Anticuerpos Los anti-P1 son unos anticuerpos frecuentes producidos de forma natural y sin significado clínico, y se puede suministrar eritrocitos para transfusiones con pruebas cruzadas compatibles a 37 °C. El alo anti-P es también un anticuerpo producido de forma natural encontrado en individuos con el raro fenotipo Pk. El autoanti-P es la especificidad atribuida al anticuerpo de Donath–Landsteiner, que es una potente hemolisina bifásica, responsable de hemoglobinuria paroxística a frigore. El anti-PP1 Pk es un anticuerpo adquirido de forma natural, a títulos altos, IgM o IgG; se encuentra sólo en individuos con el raro fenotipo p. Es reactivo a 37 °C y es capaz de producir hemólisis intravascular y EHRN. Se asocia también con abortos espontáneos en las primeras fases del embarazo.

Sistema Rh El sistema Rh, inicialmente conocido como el sistema Rhesus, fue así llamado por el anticuerpo original que fue obtenido por la inyección de eritrocitos de monos rhesus a conejos y cobayas, que reaccionaba con la mayoría de los eritrocitos humanos. Aunque posteriormente se demostró que el anticuerpo original (ahora llamado anti-LW) era diferente del anti-D, la terminología Rh ha sido mantenida para el sistema humano de grupos sanguíneos. La importancia clínica de este sistema reside en que los individuos que son D negativos sufren frecuentemente el estímulo para producir anti-D si se transfunden con sangre D positiva, o en el caso de la mujer embarazada, si está expuesta a eritrocitos fetales D positivos que cruzan la placenta.

Antígenos Rh y genes codificadores Éste es un sistema muy complejo. Para simplificarlo, es conveniente clasificar a los individuos como D positivos o D negativos, dependiendo de la presencia del antígeno D. En gran parte se trata de una medida preventiva, para evitar transfundir a receptores D negativos con células que expresen el antígeno D, que es el antígeno eritrocitario más inmunogénico después del A y el B. A un nivel más exhaustivo, es conveniente considerar el sistema Rh como un complejo de genes que ocasiona varias combinaciones de tres antígenos alternativos (C o c, D o d, y E o e) como originalmente sugirió Fisher. Se pensó que el gen d era amórfico y sin ningún antígeno correspondiente en el hematíe. Más recientemente, se ha confirmado que el locus RH está en el cromosoma 1 y comprende dos genes altamente homólogos muy estrechamente ligados, RHD y RHCE, cada uno con 10 exones. Cada gen codifica para una proteína transmembrana diferente con 417 residuos y 12 dominios transmembrana putativos. Las proteínas D y CE difieren en 35 residuos. El gen RHCE tiene cuatro alelos principales: CE, Ce, ce y cE. Las posiciones 103 y 226 en el polipéptido CE, situadas en el bucle externo, determinan respectivamente el polimorfismo C/c (serina/prolina) y E/e (prolina/alanina). Este concepto de los genes D y CcEe ligados estrechamente y transmitidos como un conjunto es compatible con la nomenclatura de Fisher.

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19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

En los individuos D negativos caucásicos, el gen RHD está suprimido, mientras que en la raza negra y otras poblaciones se han descrito mutaciones en un único punto, deleciones parciales o recombinaciones. En individuos con un antígeno D débil (Du), existe una reducción cuantitativa en los loci del antígeno D, que se cree es debida a un defecto transcripcional no caracterizado. Estos individuos no forman anticuerpos anti-D tras un contacto con el antígeno D. Los individuos D parciales carecen de uno o más epítopos del antígeno D, definido usando paneles de reactivos monoclonales. El DVI es quizás el más importante fenotipo D parcial porque estos individuos, con cierta frecuencia, forman anti-D. Los fenotipos D parciales surgen de intercambios del ADN entre los genes RHD y RHCE y de otras reorganizaciones. Cartron y Agre12, Huang13 y Avent y Reid14 han realizado extensas revisiones de este sistema. Los haplotipos Rh se identifican, bien por sus componentes antigénicos (p. ej., CDe, cde) o bien por un único símbolo abreviado (p. ej., R1 = CDe, r = cde). Así, una persona puede heredar CDe (R1) de un progenitor y cde (r) del otro y tener el genotipo CDe/cde (R1r). Los haplotipos en orden de frecuencia y sus correspondientes abreviaturas se enumeran en la tabla 19.7. Aunque se usan otras dos nomenclaturas para describir el sistema Rh, llamadas terminología Rh de Wiener y notación numérica de Rosenfield, la nomenclatura CDE, derivada de la teoría original de Fisher, es la recomendada por el World Health Organization Expert Committee15 en interés de la simplicidad y la uniformidad. Los antígenos Rh se definen por el correspondiente antisuero, con la excepción del «anti-d», que no existe. Consecuentemente, la distinción entre homocigoto DD y heterocigoto Dd no puede hacerse por pruebas serológicas directas, aunque podría determinarse por estudios familiares informativos. Es todavía una práctica rutinaria predecir el genotipo a partir del fenotipo, basándose en tablas de probabilidad para los distintos genotipos Rh de la población (v. tabla 20.3, pág. 457). Sin embargo, en mujeres con anti-D e historia de afección de un niño por EHRN, se emplea la secuenciación del ADN del RH, como prueba fetal para el estatus D, para decidir el manejo clínico del embarazo. La secuenciación del ADN requiere menos tejido fetal y puede realizarse más precozmente en el embarazo, antes de que las proteínas Rh se expresen en los eritrocitos. Las fuentes disponibles incluyen el líquido amniótico (amniocitos) y las células trofoblásticas (vellosidades coriónicas) y también se ha establecido que puede emplearse sangre materna si contiene ADN fetal16,115. En la práctica, se emplea una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple, con más de dos equipos cebadores, para detectar las diferentes bases moleculares para los fenotipos D negativos en personas no caucásicas. La secuenciación del ADN del RH tiene también aplicaciones en las pruebas de paternidad y en medicina forense. Hay diferencias raciales en la distribución de los antígenos Rh; por ejemplo, la negatividad del D es más frecuente en caucásicos (aproximadamente el 15%), mientras que el R0(cDe) se encuentra en aproximadamente el 48% de los negros americanos, pero es infrecuente (aproximadamente el 2%) en los caucásicos.

Tabla 19.7. Haplotipos Rh en orden de frecuencia (nomenclatura de Fisher) en caucásicos y nombre breve Fisher

Notaciones breves

Frecuencia aproximada (%)

CDe

R1

41

cde

r

39

cDE

R2

14

cDe

R0

3

w

C De

1w

R

1

cdE

′′

r

1

Cde

r′

1

CDE

RZ

Infrecuente

CdE

y

Infrecuente

r

Los antígenos Rh se encuentran sólo en los eritrocitos y son una parte estructural de la membrana celular. La completa ausencia de antígenos Rh (fenotipo Rh nulo) puede asociarse con una anemia hemolítica congénita con esferocitos y estomatocitos en el frotis sanguíneo, incremento de la fragilidad osmótica e incremento del transporte de cationes. Este fenotipo surge como resultado de homocigosidad para un alelo silente en el locus RH (el tipo amorfo) o, más frecuentemente, por homocigosidad para un gen autosómico supresor (X0r), genéticamente independiente del locus RH (el tipo regulador). Los antígenos Rh están bien desarrollados antes del nacimiento y pueden ser demostrados en los eritrocitos de los fetos en etapas muy tempranas.

Anticuerpos La nomenclatura de Fisher es adecuada cuando se aplica a los anticuerpos Rh, y se han descrito anticuerpos dirigidos contra todos los antígenos Rh, excepto el d: anti-D, anti-C, anti-c, anti-E y anti-e. Los antígenos Rh están restringidos a los eritrocitos y los anticuerpos Rh resultan de aloinmunizaciones previas por embarazo o transfusión, excepto para algunas formas de anti-E y anti-CW, adquiridas de forma natural. Los anticuerpos Rh inmunes son predominantemente IgG (IgG1 y/o IgG3), pero pueden tener un componente IgM. Reaccionan óptimamente a 37 °C, no fijan el complemento y su detección es a veces potenciada por el uso de eritrocitos tratados con enzimas. Por tanto, cuando ocurre hemólisis, ésta es extravascular y predominantemente en el bazo. El anti-D es el anticuerpo más importante clínicamente; puede causar reacciones transfusionales hemolíticas y era una causa frecuente de muerte fetal debida a enfermedad hemolítica del recién nacido antes de la introducción de la profilaxis anti-D. El anti-D se acompaña de anti-C en el 30% de los casos y de anti-E en el 2%. La inmunización primaria que sigue a una transfusión de células D positivas

419

420

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Sistemas Kell y Kx

Fy, que es responsable cuando es homocigoto del fenotipo Fy(a–b–) en la raza negra. Este gen Fy es idéntico al gen Fyb en su región estructural pero tiene una mutación en la región promotora, que condiciona la ausencia de producción de la glucoproteína Duffy de los eritrocitos. La glucoproteína Fy (también conocida como antígeno Duffy receptor para quimiocinas, ADRQ) es un receptor para las clases CC y CXC de quimiocinas proinflamatorias y se expresa en las células endoteliales vasculares y en las células de Purkinje en el cerebelo, pero su papel preciso como potencial recogedor del exceso de quimiocinas es desconocido. La glucoproteína Fy es también un receptor para Plasmodium vivax.

Antígenos y genes codificadores

Anticuerpos Duffy

Se han identificado veinticinco antígenos (K1–K25), pero sólo son clínicamente importantes tres juegos de alelos muy estrechamente ligados: K (KEL1) y k (KEL2); Kpa (KEL3), Kpb (KEL4) y Kpc (KEL21); y Jsa (KEL6) y Jsb (KEL7). Estos antígenos son codificados por alelos en el locus KEL del cromosoma 7, pero su producción también depende de genes en el locus KX del cromosoma X. El antígeno K está presente en el 9% de la población inglesa. El antígeno Kpb tiene una elevada frecuencia en caucásicos; el antígeno Jsb es universal en caucásicos y casi universal en la raza negra. La proteína Kell es una glucoproteína de un solo dominio transmembrana y se cree que forma un complejo con un puente disulfuro con la proteína Kx, que tiene múltiples dominios transmembrana con 10 dominios transmembrana putativos. Tiene una considerable homología en las secuencias con otras endopeptidasas neutras. En el fenotipo de McLeod, los eritrocitos carecen de Kx y hay un marcado descenso de antígenos Kell, una morfología acantocítica y una anemia hemolítica compensada. El síndrome de McLeod está ligado al cromosoma X con lenta progresión a miocardiopatía, debilidad del músculo esquelético y defectos neurológicos.

El anti-Fya es mucho más frecuente que el anti-Fyb, y el resto de los anticuerpos Duffy son raros. Son predominantemente IgG1 y a veces fijan complemento.

se hace aparente en 2-5 meses, pero puede no ser detectable tras exposición a pequeñas dosis de células D positivas en el embarazo. Sin embargo, una segunda exposición a células RhD positivas en un embarazo posterior provocará una rápida respuesta inmune de células con memoria o secundaria. De los anticuerpos Rh no D, el anti-c es el más frecuentemente encontrado y puede también provocar una grave enfermedad hemolítica del feto o del recién nacido. El antiE es menos frecuente, mientras que anti-C es raro en ausencia de anti-D.

Anticuerpos Kell El anti-K inmune es el anticuerpo que se detecta con mayor frecuencia después de los de los sistemas ABO y Rh. Generalmente es IgG1 y ocasionalmente se une al complemento. Otros anticuerpos inmunes dirigidos contra los antígenos Kell son menos frecuentes. La presencia de algunos de estos anticuerpos, tales como anti-k, anti-Kpb y anti-Jsb, pueden causar importantes dificultades en la selección de unidades antígeno negativas para una transfusión.

Sistema Kidd (JK) Antígenos Kidd y genes codificadores Los genes del locus HUT11 (JK) en el cromosoma 18 codifican para una proteína de múltiples dominios transmembrana, que transporta tanto los antígenos Kidd como el transportador de urea eritroide humano. Los alelos codominantes Jka y Jkb producen un polimorfismo en HUT11, que difiere por la sustitución de un único aminoácido en la posición 280 (Asp/Asn). El fenotipo Jk(a–b–) es muy raro y está causado por herencia homocigota del alelo silente Jk en el locus JK o por herencia del gen dominante inhibidor In (Jk) no ligado al locus JK. Estas células Jk(a–b–) son resistentes a la lisis por soluciones de urea y tienen un defecto selectivo en el transporte de urea.

Anticuerpos Kidd El anti-Jka es más frecuente que el anti-Jkb; ambos suelen ser IgG. Los anticuerpos Kidd normalmente fijan complemento, lo que se cree debido a que la mayoría de ellos contienen una fracción IgG3. El anti-Jk3 es producido por los individuos del fenotipo Jk(a–b–). Los anticuerpos Kidd pueden ser difíciles de detectar, porque a veces aparecen dosificados (pueden sólo reaccionar con células con expresión homocigota de Jka y Jkb), disminuyen a niveles indetectables en plasma y están a menudo presentes en mezclas de aloanticuerpos.

Sistema MNSs Sistema Duffy Antígenos MNSs y genes codificantes Antígenos Duffy y genes codificadores El locus Duffy (Fy) está en el cromosoma 1 y codifica para una proteína de múltiples dominios transmembrana con siete o nueve dominios putativos. El locus tiene los siguientes alelos: Fya, Fyb, que codifican para los antígenos codominantes Fya y Fyb, respectivamente; Fyx, que es responsable de un antígeno débil Fyb, y

El GYPA y el GYPB son genes estrechamente ligados situados en el cromosoma 4, que codifican para la glucoforina A (GPA) y la glucoforina B (GPB), respectivamente. Tanto GPA como GPB son sialoglucoproteínas con un solo dominio transmembrana. El M y el N son alelos del GYPA (que codifican los antígenos M y N en GPA), y S y s son alelos de GPYB (que codifican los antígenos S y s en GPB). Se

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

han descrito muchas variantes raras debidas a deleción de genes, mutaciones e intercambios de segmentos. El antígeno U se encuentra en los eritrocitos de los caucásicos y en el 99% de la raza negra. Los individuos U-negativos son, salvo raras excepciones, S–s– y carecen o tienen una forma anómala de GPB.

Tabla 19.8. Especificidades de los anticuerpos relacionados con el mecanismo de destrucción inmune Sistema grupo sanguíneo

Hemólisis intravascular

ABO,H

A, B, H

Rh

Anticuerpos MNSs El anti-M es un anticuerpo relativamente común que puede ser IgM o IgG. En raros casos son reactivos a 37 °C, que es cuando pueden producir una reacción transfusional hemolítica. El anti-M muy rara vez provoca una EHRN. El anti-N es infrecuente y no tiene significado clínico. Los anti-S y anti-s son normalmente IgG; en raras ocasiones se ha descrito su implicación en reacciones transfusionales hemolíticas y EHRN. El anti-U es un raro anticuerpo inmune, que generalmente contiene un componente IgG1. Se sabe que causa reacciones transfusionales hemolíticas fatales y EHRN grave.

Hemólisis extravascular

All

Kell

K

K, k, Kpa, Kpb, Jsa, Jsb

Kidd

Jka

Jka, Jkb, Jk3

Duffy

Fya, Fyb

MNS

M, S, s, U

Lutheran

Lub Lea

Lewis Cartwright

Yta

Colton

Coa, Cob

Dombrock

Doa, Dob

Otros sistemas de grupos sanguíneos Sistema Lutheran Los antígenos del sistema Lutheran no están bien desarrollados en el momento del nacimiento, y como consecuencia de ello no hay casos documentados de enfermedad hemolítica clínicamente significativa debida a anticuerpos Lutheran. El Anti-Lua es infrecuente y rara vez tiene significado clínico. El anti-Lub ha causado hemólisis extravascular.

Sistema Yt (Cartwright) a

b

Los antígenos Yt e Yt se encuentran en la acetilcolinesterasa ligada a GPI. Algunos ejemplos de anti-Yta han causado destrucción acelerada de eritrocitos.

Sistema Colton Los antígenos del sistema Colton (Coa y Cob) son transportados por la proteína transportadora de agua, proteína integral formadora de canal (CHIP-1). El Anti-Coa y el menos frecuente anti-Cob son a veces clínicamente significativos.

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Sistema Dombrock Los antígenos del sistema Dombrock son Doa y Dob, así como los antígenos de elevada incidencia Gya, Hy y Joa. Los anticuerpos de este sistema son generalmente débiles, pero todos deberían ser considerados potencialmente significativos.

Significado clínico de los aloanticuerpos de los eritrocitos En la tabla 19.8 se describe la importancia de los aloanticuerpos descritos con respecto a la naturaleza de la reacción transfusional hemolítica que producen. Sin embargo, la mayoría de las reacciones transfusionales son el resultado de una incompatibilidad ABO17, como se muestra en la tabla 19.9.

Tabla 19.9. Reacciones transfusionales hemolíticas agudas fatales comunicadas a la FDA en los Estados Unidos entre 1976 y 1985 Incompatibilidad

N.º de muertes

Receptor O y eritrocitos A

80

Receptor O y eritrocitos B/AB

26

Receptor B y eritrocitos A/AB

12

Receptor A y eritrocitos B

6

Plasma O a receptor A/AB

6

Plasma B a receptor AB

1

Total de incompatibilidades ABO

131

Anti-K

5

Anti-E+K+P1

1

Anti-Jkb

1

Anti-Jka+Jkb+Jk3

1

a

Anti-Fy

1

Total de incompatibilidades no ABO

9

Mollison y cols.18 analizaron la importancia de los antígenos del grupo sanguíneo diferentes del sistema ABO y D, examinando la prevalencia de aloanticuerpos de eritrocitos inducidos por transfusión, excluyendo los anti-D, -CD y -DE (tabla 19.10). Los anticuerpos Rh, principalmente anti-c o anti-E, constituyen el 53% del total y los anti-K y antiFya un 38% adicional, dejando sólo un 9% para el resto de las especificidades. En un grupo menor de pacientes que experimentaron reacciones transfusionales hemolíticas (RTH) inmediatas, se encontró una distribución similar de los

421

422

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tabla 19.10.

Frecuencia relativa de anticuerpos antieritrocitarios aloinmunesa Aloanticuerpos de grupo sanguíneo (% del total)

Grupo de los pacientes

N.° estudiado

Rhb

K

Fy

Jk

Otros

Transfundidos (algunos embarazos)

5.228

53,1

28,1

10,2

4,0

4,7

RTH inmediatac

142

42,2

30,3

18,3

8,5

0,7

RTH retardadac

82

34,2

14,6

15,9

32,9

2,4

a

Excluyendo anticuerpos ABO, Lewis, sistema P y anti-M y anti-N. b Excluyendo anti-D (o -CD o -DE); casi todos fueron anti-c o anti-E. c Reacción transfusional hemolítica. Modificado de Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M, 1997. Blood transfusion in clinical medicine, 9th ed. Blackwell Scientific, Oxford, pág. 112, basada en datos publicados de varias fuentes.

diferentes anticuerpos antieritrocitos. Sin embargo, las estadísticas para las RTH retardadas muestran un llamativo incremento en la frecuencia relativa de los anticuerpos Jk, lo que refleja las características resumidas de los anticuerpos Jk. La enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido no se ha asociado con anticuerpos dirigidos contra los antígenos Lewis, y sólo se produce una enfermedad muy leve con anti-Lua y anti-Lub. Con estas excepciones, el resto de los anticuerpos IgG dirigidos contra antígenos de los sistemas mencionados deberían considerarse capaces de causar hemólisis en esta situación. El significado de los muchos otros antígenos de los eritrocitos no referidos en el texto se resume en la tabla 19.11. Sin embargo, debería resaltarse que los anticuerpos enumerados suelen ser completa o predominantemente IgG y deberían ser detectables en las pruebas pretransfusionales rutinarias usando la prueba de antiglobulina indirecta (PAI). Es difícil encontrar sangre adecuada para transfundir a un paciente cuyo suero contiene anticuerpos, como los anti-Vel, que tienen una especificidad para un antígeno de alta frecuencia y que puede causar una reacción transfusional hemolítica grave. Además del empleo de una unidad de sangre congelada, debería considerarse la sangre autóloga y, si es necesario, debería investigarse la compatibilidad de los hematíes de familiares cercanos (particularmente hermanos). Los anticuerpos como los anti-Kna se encuentran con frecuencia; no son clínicamente importantes, aunque su presencia puede retrasar el suministro de la sangre hasta que se haya determinado su especificidad.

Mecanismos de destrucción inmune de los eritrocitos La hemólisis de los eritrocitos mediada por inmunidad depende de lo siguiente19: 1. La clase de inmunoglobulina del anticuerpo (a efectos prácticos, los anticuerpos dirigidos contra los antígenos de los eritrocitos son IgM, IgG o ambas). 2. La capacidad del anticuerpo de unirse al complemento. 3. La interacción con el sistema reticuloendotelial (sistema

mononuclear fagocítico). El fagocito más importante que participa en la hemólisis inmune es el macrófago, predominantemente en el bazo. El mecanismo de la hemólisis inmune también determina el lugar de la hemólisis: a) Hemólisis intravascular. Es debida a la unión secuencial de componentes de la cascada del complemento (C1 a C9) y a la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC; C5b678[9]n). Esto es característico de los anticuerpos IgM, pero algunos anticuerpos IgG pueden también actuar como hemolisinas. En las reacciones transfusionales con incompatibilidad ABO, los eritrocitos en general se destruyen por lisis intravascular debida al complemento (v. pág. 471). La mayor parte de la destrucción aloinmune restante de los eritrocitos es extravascular y está mediada por el sistema mononuclear fagocítico. Los autoanticuerpos de los eritrocitos pueden también causar lisis intravascular, sobre todo los autoanticuerpos IgG de la HPF (v. pág. 219) y algunos autoanticuerpos de la enfermedad por hemoaglutininas frías (CHAD) (v. pág. 218). La lisis intravascular mediada por complemento también puede producirse en la hemólisis inmune mediada por fármacos (v. pág. 221). b) Hemólisis extravascular. Está mediada por el sistema mononuclear fagocítico, es característica de los anticuerpos IgG y se produce principalmente en el bazo. Está causada por anticuerpos IgG no ligados a complemento o por aquellos que ligan cantidades sublíticas de complemento. Los macrófagos tienen receptores Fcγ para la unión de la IgG a la célula, y los eritrocitos sensibilizados pueden ser completamente fagocitados o perder parte de su membrana y retornar a la circulación como microesferocitos. Los esferocitos son menos deformables y quedan más fácilmente atrapados en el bazo que los eritrocitos normales, lo que acorta su período de vida. Además de la fagocitosis mediada por el receptor Fc, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) puede también contribuir al daño celular durante el contacto cercano con los macrófagos esplénicos. Los

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

Tabla 19.11.

Antígenos de grupos sanguíneos menores

Antígeno

Frecuencia del antígeno en caucásicos (%)

RTH asociadas

EHRN asociada

Comentarios

Dia Dib

0 100

Sí Sí

Sí Sí

Parte del sistema DI. Dia Más frecuente en indios americanos y orientales

Wra

99,9 99,9

Algunas Algunas

No No

7 antígenos en el sistema GE

Cra

100

Algunas

No

10 antígenos en el sistema CR

Ch1 Rg1

96 98

No No

No No

9 antígenos en los sistemas CH/RG, radica en C4

Kna McCa Yka

98 98 92

No No No

No No No

Pertenece al sistema KN de 5 antígenos

Ina Inb

0,1 99

Sí Sí

No No

Ina tiene una incidencia del 4% en indios asiáticos

LWa

100

Algunas

Leve

—

JMH

>99,9

No

No

Una de las 901 series de antígenos de elevada incidencia

Vel

>99,9

Sí

No

Una de las 901 series; unión al complemento

Bga

Aprox. 15

No

No

Corresponden a HLA-B7, detectable en los eritrocitos

Xg

a

EHRN: enfermedad hemolítica del recién nacido; RTH: reacción transfusional hemolítica.

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eritrocitos son destruidos fuera de la membrana del monocito por enzimas lisosomales secretadas por esta célula20. Los componentes del complemento pueden favorecer la destrucción de los eritrocitos. La activación del complemento por algunos anticuerpos IgM y la mayoría de los IgG no es siempre completa y los eritrocitos escapan de la lisis intravascular. La activación del complemento se detiene en la fase C3 y, en estas circunstancias, puede detectarse complemento en los eritrocitos por la prueba de antiglobulina usando reactivos anticomplemento apropiados. El primer producto de activación de C3 es el C3b ligado a la membrana, que de forma constante es degradado a C3bi. Los eritrocitos con estos componentes en su superficie se adhieren a fagocitos (monocitos, macrófagos y granulocitos), que tienen receptores de complemento CR1 (CD35) y CR3 (CD11b/CD18). Estas células sensibilizadas son rápidamente secuestradas en el hígado por su elevada masa de células fagocíticas (Küpffer) y su gran flujo sanguíneo,

pero no se produce destrucción de las mismas. Cuando se escinde C3bi, dejando sólo C3dg en la superficie celular, las células marcadas con C3dg «inactivo» regresan a la circulación, como en la enfermedad crónica por hemaglutininas. Sin embargo, cuando también hay IgG en la superficie celular, C3b favorece la fagocitosis, y en estas circunstancias tanto el hígado como el bazo son lugares importantes de hemólisis extravascular. De este modo, C3b y C3bi aumentan el aclaramiento mediado por macrófagos de células recubiertas de IgG, y los anticuerpos ligados a cantidades sublíticas de complemento (p. ej., anticuerpos Duffy y Kidd) pueden causar una destrucción más rápida y síntomas más marcados que los anticuerpos que no fijan complemento (p. ej., anticuerpos Rh). La actividad de los macrófagos es un importante componente de la destrucción celular, y estudios adicionales de las interacciones celulares en esta fase de la hemólisis inmune podrían aportar una explicación para las diferentes intensidades de la hemólisis en pacientes con anticuerpos aparentemente iguales. Para valorar este aspecto de la he-

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

mólisis inmune se han introducido análisis in vitro con macrófagos (monocitos) que complementan las técnicas serológicas convencionales21. Entre los factores que pueden afectar la interacción entre células sensibilizadas y macrófagos se incluyen los siguientes: 1. Subclase de IgG. Los anticuerpos IgG1 e IgG3 tienen una mayor afinidad de unión a los receptores mononucleares Fcγ que los anticuerpos IgG2 e IgG4. 2. Densidad del antígeno. Número de moléculas de anticuerpo unidas a la superficie celular. 3. IgG en fase fluida. La concentración en suero de IgG es un determinante de la función mononuclear-fagocítica dependiente de Fc. Niveles normales de IgG bloquean la adherencia in vitro de los eritrocitos sensibilizados a los receptores Fc de los monocitos (particularmente FcγR1). La hemoconcentración en los sinusoides esplénicos es probablemente un factor importante para minimizar este efecto in vivo, lo que puede explicar por qué el bazo es unas 100 veces más eficaz que el hígado para eliminar las células sensibilizadas por IgG, a pesar de la mayor masa de macrófagos y mayor flujo sanguíneo hepáticos. El efecto inicial de IgG i.v. a alta dosis es causar un bloqueo del receptor FcγR del macrófago. Esto reduce el aclaramiento inmune de células recubiertas de anticuerpos y tiene una particular aplicación en el manejo de la trombocitopenia autoinmune y la púrpura postransfusional. 4. Regulación de la actividad de los macrófagos. Actualmente se sabe que las citocinas son importantes en la estimulación de los receptores de macrófagos. El interferón gamma favorece la actividad fagocítica de los macrófagos por aumento de la expresión de FcγRI in vitro e in vivo, y también activa FcγII sin incrementar el número de estos receptores22. La interleucina-6 también favorece la activación del FcγRII e incrementa la actividad del receptor CR1, que ocurre a través de la acción de las citocinas de las células T y a través de agentes quimiotácticos liberados en la respuesta inflamatoria23. En pacientes con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica se han monitorizado los niveles incrementados de citocinas proinflamatorias y otros mediadores biológicos y sus efectos sobre la actividad del sistema fagocítico monocítico24. Es por tanto posible que la liberación de citocinas durante las infecciones víricas y bacterianas pudiera, al menos en parte, desencadenar algún episodio de destrucción celular autoinmune. La tasa de destrucción inmune está, por tanto, determinada por las características del antígeno y el anticuerpo y el nivel de activación del sistema fagocítico monocítico.

Reacciones antígeno-anticuerpo El glóbulo rojo es un marcador práctico de las reacciones serológicas. La aglutinación o lisis (debida a la acción del complemento) es un indicador visible (variable de valora-

ción) de la reacción antígeno-anticuerpo. La reacción ocurre en dos fases: en la primera el anticuerpo se une al antígeno del glóbulo rojo (sensibilización); la segunda implica la aglutinación (o lisis) de las células sensibilizadas. La primera fase (es decir, asociación del anticuerpo con el antígeno [sensibilización]) es reversible y la fuerza de unión (constante de equilibrio) depende de la «exactitud de encaje» entre el antígeno y el anticuerpo. Esto se ve influido por los siguientes factores: 1. Temperatura. Los anticuerpos fríos (usualmente IgM) suelen fijarse mejor al hematíe a baja temperatura (p. ej., 4 °C), mientras que los anticuerpos calientes (usualmente IgG) se fijan más eficazmente a temperatura corporal (es decir, 37 °C). 2. pH. En un intervalo de pH de 5,5-8,5, hay relativamente poco cambio en la unión de los anticuerpos, pero para asegurar resultados comparables es preferible tamponar la solución salina en que se diluye el suero o las células para fijar el pH, generalmente a 7,0. Algunas técnicas de elución de anticuerpos se basan en la alteración del pH a menos de 4 o más de 10. 3. Fuerza iónica del medio. Una baja fuerza iónica incrementa la tasa de unión de los anticuerpos. Ésta es la base de las pruebas de detección de anticuerpos que emplean solución salina de baja fuerza iónica (LISS). La segunda fase se basa en varias manipulaciones de laboratorio para promover la aglutinación o lisis de las células sensibilizadas. La superficie celular está cargada negativamente (principalmente debido a residuos de ácido siálico), lo que mantiene separadas las células individuales; la distancia mínima entre eritrocitos suspendidos en solución salina es de alrededor de 18 nm. La aglutinación se debe al entrecruzamiento que los anticuerpos facilitan entre las células. El espacio entre los lugares de unión al antígeno en las moléculas de IgM (30 nm) es suficiente para permitir a los anticuerpos IgM formar un puente entre los eritrocitos suspendidos en solución salina (después de asentarse) y así causar aglutinación. Las moléculas de IgG tienen un espacio más corto (15 nm) y normalmente son incapaces de aglutinar los eritrocitos sensibilizados suspendidos en solución salina; no obstante, la intensa sensibilización con IgG debida a alta densidad del antígeno disminuye las fuerzas repulsivas intercelulares y es capaz de promover la aglutinación en solución salina (p. ej., IgG anti-A, anti-B). La aglutinación de eritrocitos cubiertos tanto por IgM como por IgG aumenta por centrifugación. Sin embargo, es el procedimiento estándar para promover la aglutinación de eritrocitos sensibilizados por IgG por lo siguiente: 1. Reduciendo la distancia intercelular mediante pretratamiento de los eritrocitos con enzimas proteasas (p. ej., papaína o bromelina), que reducen la carga de la superficie celular de los eritrocitos (v. pág. 426). 2. Añadiendo polímeros (p. ej., albúmina), aunque el mecanismo por el que la albúmina u otros polímeros solubles en agua aumentan la aglutinación es incierto.

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

3. Creando puentes entre células sensibilizadas con un reactivo de antiglobulina en las pruebas de la antiglobulina (v. pág. 430). Algunos anticuerpos que fijan complemento (especialmente IgM) pueden causar lisis in vitro (sin aglutinación perceptible), que puede ser favorecida por la adición de suero fresco como fuente de complemento. Sin embargo, la activación del complemento únicamente puede pasar hasta la fase C3; en estas circunstancias, el C3 unido a la célula puede ser detectado por la prueba de antiglobulina empleando un reactivo anticomplemento apropiado (v. pág. 430).

Control de calidad en el laboratorio

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Desde hace tiempo se ha apreciado que las pruebas usadas para los análisis pretransfusionales rutinarios son de suma importancia, porque los errores pueden conducir y conducen a morbilidad y mortalidad del paciente. Por ello no debe sorprender que en la Unión Europea todos los reactivos, calibradores y materiales de control para la determinación del grupo sanguíneo y de la presencia de «anticuerpos antieritrocitos irregulares» hayan sido incluidos en la In-vitro Diagnostics (IVD) Medical Devices Directive25 (v. también pág. 562). Esto quiere decir que todos los reactivos vendidos en la Unión Europea deben llevar la marca CE para demostrar que cumplen las especificaciones técnicas comunes (CTS) acordadas. En cada país europeo, la autoridad competente podrá retirar o suspender las certificaciones de cualquier agente, dependiendo de la información recibida desde su centro de notificación, que dará la aprobación para la puesta a la venta de los lotes y controlará el rendimiento del fabricante y del producto. La llegada de esta directiva refuerza aún más las potenciales responsabilidades de un laboratorio individual, que asume la responsabilidad del producto de un fabricante, si los reactivos se hacen de «forma casera» o si los métodos recomendados por el fabricante no se siguen estrictamente. La mayoría de los siguientes puntos han sido tomados de la guía del British Committee for Standards in Haematology (BCSH)26,27 para pruebas de compatibilidad pretransfusionales:

1. Aspectos generales a) El laboratorio debería documentar un sistema de calidad adecuado a sus necesidades. b) Debería prestarse atención a la inclusión de controles internos en todas las pruebas realizadas. c) El laboratorio debería participar en ejercicios de evaluación externa de la calidad. d) El laboratorio debería hacer sólo uso de sistemas que hayan sido validados con requisitos documentados. e) El laboratorio debería asegurar que tiene procedimientos para detectar fallos en los equipos informatizados y ordenadores. El laboratorio debería desarrollar procedimientos para incorporar controles en todos los puntos

críticos de las pruebas transfusionales (p. ej., preservación de la identidad de las muestras del paciente, trascripción de los resultados, etc.).

2. Reactivos a) El director del laboratorio debería referirse a las especificaciones disponibles para un reactivo determinado, por ejemplo, la International Society of Blood Transfusion (ISBT), la American Association of Blood Banks (AABB) o las «Guidelines for the Blood Transfusion Services»28,29. b) Todos los reactivos o sistemas deberían ser usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando esto no fuera posible, el procedimiento debería ser validado de acuerdo con la guía del BCSH sobre evaluación, validación e implementación de nuevas técnicas para la determinación del grupo sanguíneo, la detección de anticuerpos y pruebas cruzadas30. c) Debería haber un registro de todos los números de lote y fechas de caducidad de los reactivos usados en el laboratorio.

3. Técnicas a) Todos los procedimientos usados deberían estar de acuerdo con la práctica recomendada como se resume aquí. b) Es esencial que la técnica de antiglobulina escogida haya sido validada de acuerdo con los requisitos documentados del laboratorio y haya estado sujeta a minuciosos análisis de campo antes de ser introducida en el laboratorio31. c) Todos los cambios en las técnicas deben ser minuciosamente validados de acuerdo con la guía del BCSH sobre evaluación, validación e implementación de nuevas técnicas antes de ser introducidos para uso rutinario. d) Los procedimientos normalizados de trabajo (PNT) autorizados por escrito, que cubran todos los aspectos del trabajo del laboratorio, deben estar disponibles y revisarse regularmente. e) Los controles regulares y el mantenimiento de todos los equipos de laboratorio deben estar documentados. En particular, debería haber una procedimiento documentado de garantía de calidad para lavadoras de células (p. ej., usando el anti-D estándar del National Institute of Biological Standards and Control [NIBSC])32 (v. página 591).

4. Formación y preparación del personal a) Debería existir un programa documentado para formación del personal del laboratorio que cubra todos los PNT en uso y que cumpla los requisitos documentales del laboratorio. b) El trabajo del laboratorio debería ser asumido sólo por personal apropiadamente entrenado. c) Debería existir un programa documentado para evaluar la suficiencia del personal (p. ej., pruebas de repetición de la PAI), que deberían incluir indicadores para iniciar acciones de reciclado33.

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

5. Auditoría y revisión de la práctica a) Debería haber un sistema instaurado para documentar y revisar todas las incidencias de ausencia de cumplimiento de los procedimientos. b) Los sistemas deberían permitir una completa auditoría de seguimiento de los pasos del laboratorio, incluyendo los resultados originales, interpretaciones, autorizaciones y todo el personal responsable de la realización de cada paso. c) Debería ser llevado a cabo un programa de auditorías independientes para evaluar la conformidad con los procedimientos documentados «en casa».

6. Salud y seguridad Cuando sea apropiado, los reactivos deberían haber sido evaluados para el virus de la inmunodeficiencia humana y el virus de la hepatitis B y C. Todas las muestras de alto riesgo deben ser manejadas de acuerdo con el código de seguridad del laboratorio (v. cap. 25).

Puntos generales de la técnica serológica Suero frente a plasma Para la detección de aloanticuerpos de eritrocitos es preferible el suero al plasma. No obstante, el plasma se usa cada vez más por la comodidad en la tecnología de microplacas y en los sistemas automatizados. Cuando se emplea plasma, el complemento es inactivado por el anticoagulante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Esto es relevante para la detección de algunos anticuerpos que fijan complemento (p. ej., de especificidad Kidd) que podría no detectarse o dar sólo reacciones débiles con anti-IgG en la prueba rutinaria de antiglobulina, pero puede ser fácilmente detectado por anti-complemento (v. pág. 430). Es por ello esencial optimizar la sensibilidad de las técnicas para detectar anticuerpos IgG débiles y validar el procedimiento antes de emplear plasma (v. página 431). Por ejemplo, en la detección de anticuerpos, puede conseguirse incrementar la sensibilidad mediante el uso de paneles celulares con expresión homocigota de los antígenos seleccionados (v. pág. 457).

Las muestras de sangre total se deterioran con el tiempo. Los problemas asociados con el almacenaje incluyen lisis de eritrocitos, pérdida del complemento en el suero, descenso de la potencia de los anticuerpos eritrocitarios, particularmente de los anticuerpos IgM, y contaminación bacteriana. Sin embargo, y sin pruebas definitivas, se ha sugerido que la sangre total puede almacenarse a temperatura ambiente hasta 48 h y a 4 °C hasta 7 días. Se recomienda que los laboratorios evalúen la estabilidad de los anticuerpos débiles, antes de tomar decisiones locales sobre las condiciones de almacenaje. El suero o plasma del paciente se almacena mejor congelado a –20 °C o menos en viales de plástico de 1-2 ml de volumen. La descongelación repetida de una muestra es peligrosa. Si el suero se ha conservado a –20 °C o menos, no se requieren precauciones con respecto a la esterilidad. El complemento se deteriora rápidamente en muestras almacenadas, pero cuando se separa el suero de la sangre tan rápido como sea posible y se conserva a –20 °C mantiene la mayor parte de la actividad del complemento durante 1-2 semanas. Para las pruebas de compatibilidad, las muestras de suero deberían separarse de los eritrocitos tan pronto como sea posible y conservarse a –20 °C hasta su uso, porque el contenido de complemento puede ser importante para la detección de algunos anticuerpos.

Suspensiones de eritrocitos Solución salina de fuerza iónica normal Generalmente se recomienda una suspensión al 2-3% de eritrocitos lavados en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con pH 7,0. Las células suspendidas en solución salina con fuerza iónica normal (NISS) se usan rutinariamente para la titulación de anticuerpos, pero su uso en pruebas pretransfusionales rutinarias ha disminuido en la última década, dado que observaciones obtenidas de los ejercicios de evaluación externa de la calidad han demostrado que los laboratorios que emplean NISS tienen una tasa de detección de anticuerpos inferior que los que utilizan otras tecnologías34.

Solución salina de baja fuerza iónica Recogida y almacenaje de muestras de sangre La identificación positiva de los pacientes y el cuidadoso etiquetado de las muestras de sangre son esenciales para evitar errores en la identificación. Para la determinación del grupo sanguíneo es deseable sangre venosa y deberían extraerse 5-10 ml de sangre y dejarla coagular a temperatura ambiente o anticoagular con EDTA en un tubo de cristal estéril. Esto proporcionará suero o plasma y eritrocitos. Si se requiere suero urgentemente, la muestra puede ser colocada en un baño de agua a 37 °C y centrifugada tan pronto como se vea que se ha empezado a formar y retraer el coágulo.

Almacenaje de suero o plasma Debe ponerse gran cuidado en identificar y etiquetar correctamente cualquier muestra de suero o plasma separada de la muestra original.

Se sabe que la tasa de asociación de los anticuerpos con los antígenos de los eritrocitos se favorece disminuyendo la fuerza iónica del medio en el que se produce la reacción. Así, una importante ventaja de la solución salina de baja fuerza iónica (LISS) es que el período de incubación en la PAI (v. pág. 431) puede acortarse, mientras la sensibilidad para la mayoría de los anticuerpos contra antígenos de los eritrocitos se mantiene o incrementa. La solución LISS puede hacerse en el laboratorio (v. pág. 588) o comprarse comercialmente. Existía una reticencia histórica a usar medios de baja fuerza iónica en los laboratorios de trabajo por dos razones: a) puede ocurrir aglutinación no específica cuando se usan concentraciones de NaCl inferiores a 2 g/l (0,03 mol/l), y b) con fuerzas iónicas bajas los componentes del complemento se unen a los eritrocitos.

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

Para evitar los resultados falsos positivos, deberían seguirse las siguientes reglas: 1. Los eritrocitos suspendidos en LISS y el suero o plasma deberían incubarse con volúmenes iguales; se recomienda emplear 2 volúmenes de células con 2 volúmenes de suero para asegurar la molaridad óptima en la prueba, del orden de 0,09 mol. Doblando la proporción suero:célula (disminuyendo a la mitad la concentración celular del 3 al 1,5%) se favorece la detección de algunos anticuerpos (p. ej., anti-K) que podrían de otro modo ser pasados por alto35. 2. Los eritrocitos deberían lavarse en solución salina dos veces y luego una vez en LISS antes de preparar la suspensión celular en LISS al 1,5-2%. 3. La solución de trabajo de LISS debe estar preparada recientemente y debe mantenerse a temperatura ambiente. 4. La velocidad y el tiempo de centrifugación deberían ser óptimos para obtener la máxima sensibilidad sin reacciones falso-positivo o falso-negativo (v. pág. 433).

Método de papaína en dos fases

Para la determinación del grupo ABO y RhD, y del fenotipo Rh, así como para la detección e identificación de anticuerpos, se requieren eritrocitos de fenotipos seleccionados (v. cap. 20). Estas células se pueden obtener comercialmente o en centros de transfusiones sanguíneas.

Para el método de papaína en dos fases38, añadir a un tubo de plástico de 10 × 75 mm, 1 volumen de papaína al 1% (activada como se ha descrito anteriormente) a 9 volúmenes de tampón fosfato de Sorensen, a pH 7,0 (v. pág. 589). Incubar a 37 °C volúmenes iguales de papaína diluida recientemente y concentrado de eritrocitos lavados durante un período de tiempo que debe determinarse para cada lote de papaína dependiendo de la actividad de azoalbúmina; normalmente es 15-30 min. Después de la incubación, lavar las células con dos cambios de solución salina, a pH 7,0, y entonces diluir lo que se requiera hasta el 3% en NISS o el 1,5% en LISS. Para la prueba de NISS, añadir 1 gota de células suspendidas en NISS a 1 gota de suero. Para la prueba de LISS, añadir 2 gotas de células suspendidas en LISS a 2 gotas de suero. Incubar durante 15 min en un baño a 37 °C.

Uso de células tratadas con enzimas

Preparación de solución de bromelina39

Los eritrocitos tratados con enzimas son reactivos útiles en la detección e investigación de autoanticuerpos y aloanticuerpos. Para este propósito se usan actualmente la papaína y la bromelina. Se sabe que el tratamiento enzimático incrementa la avidez de los anticuerpos, tanto IgM como IgG. Los receptores de algunos antígenos de los eritrocitos, sin embargo, pueden ser inactivados por el tratamiento enzimático (p. ej., M, N, S, Fyb). Las técnicas más sensibles son aquellas que usan eritrocitos lavados pretratados con enzimas (dos fases), que deberían igualar el rendimiento de la prueba de antiglobulina con LISS en tubo de centrifugación (v. pág. 431). La unión de técnicas de una fase e inhibición con papaína es relativamente insensible y no se recomiendan actualmente. Existe una lista de centros36 que disponen de un estándar de proteasa del ISBT/International Council for Standardization in Haematology (ICSH) y del método para su empleo.

Preparar una solución al 0,5%, diluyendo bromelina en polvo en una mezcla de 9 volúmenes de solución salina y un volumen de tampón fosfato de Sorensen, pH 5,4 (v. página 589). Almacenar la solución en volúmenes de 0,5-1,0 ml a –20 °C; a esta temperatura se mantendrá durante meses. Como conservantes, añadir azida de sodio al 0,1% y actidiona al 0,5% (un fungicida). Añadir la bromelina al suero justo antes de añadir los eritrocitos, del mismo modo en que la papaína se añade en la técnica de Low. No es necesario pretratar los eritrocitos con la enzima. La actividad de la bromelina puede estandarizarse mediante un análisis con azoalbúmina como con la papaína. Los controles son particularmente importantes cuando se usan células pretratadas con enzimas y deben usarse para establecer sin dudas que las células modificadas reaccionan apropiadamente con un suero con un contenido conocido de anticuerpos. Sólo de este modo puede evaluarse la potencia de la enzima y el método del tratamiento enzimático. Las células tratadas con enzimas son comparadas con células no tratadas, en reacciones con un control positivo (0,25 UI/ml de anti-D) y un control negativo (suero AB o suero fresco compatible).

No es frecuente, pero aún pueden ocurrir reacciones falso-positivo con algunos sueros/plasmas. Si se utiliza plasma, el trabajo serológico posterior puede realizarse usando NISS; si se emplea suero, debería usarse anti-IgG en vez de reactivo antiglobulina poliespecífico.

Reactivos de eritrocitos

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de tampón fosfato de Sorensen, pH 5,4 (v. pág. 589). Centrifugar durante 10 min y añadir 10 ml de clorhidrato de cisteína 0,5 mol/l al sobrenadante para activar la enzima. Diluir la solución hasta 200 ml con el tampón fosfato e incubar durante una hora a 37 °C. Dispensar la enzima en pequeños volúmenes (p. ej., 0,1-0,2 ml); esta suspensión se mantiene satisfactoriamente durante muchos meses a –20 °C, pero una vez descongelados los tubos, la solución que no se use inmediatamente debe desecharse. La actividad enzimática debería estandarizarse usando un análisis con azoalbúmina37, porque ésta determinará el tiempo de incubación para el tratamiento enzimático de las células. La preparación enzimática debería también compararse con el estándar de papaína del ISBT/ICSH usando el mismo lote de azoalbúmina, y así servir como un estándar «hecho en la casa»36.

Preparación de la solución de papaína (método de Low) Una solución de papaína al 1% se prepara del siguiente modo: triturar 2 g de papaína en un mortero con 100 ml

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Aglutinación de eritrocitos por anticuerpos: un método básico Las pruebas de aglutinación suelen realizarse en tubos o placas de microtitulación, usando centrifugación o sedimentación. Las pruebas en porta se usan a veces para determinaciones de emergencia del grupo ABO y RhD (v. págs. 453 y 454). Para pruebas en microplacas, véase página 454.

Pruebas en tubo Añadir 1 volumen de suspensión de eritrocitos al 2% a 1 volumen de suero o dilución de suero en un tubo de plástico desechable o tubo de cristal. Mezclar bien y dejar reposar durante el tiempo apropiado (v. más adelante).

Tubos Para pruebas de aglutinación, usar tubos de plástico desechables o de cristal de mediano tamaño (75 × 10 o 12 mm). Para las pruebas de lisis deberían usarse tubos similares, dado que es esencial tener una capa relativamente amplia de suero para mirar a su través, si tienen que detectarse pequeñas cantidades de lisis. El nivel de fluido debe subir muy por encima de la parte inferior cóncava de los tubos. Los tubos de cristal deberían usarse siempre que su contenido tenga que calentarse a temperaturas de 50 °C o superiores o si se emplean solventes orgánicos. Los tubos de cristal, sin embargo, son difíciles de limpiar satisfactoriamente, en especial los tubos de pequeño calibre, y deberían seguirse cuidadosamente métodos de limpieza similares a los explicados en la página 695.

Temperatura y tiempo de exposición de los eritrocitos al anticuerpo En la serología del grupo sanguíneo, las pruebas con tubo generalmente se hacen a 37 °C, temperatura ambiente o ambas. Es algo más ventajoso usar baños de agua a 20 °C, en vez de depender de la «temperatura ambiente», que en los diferentes países y estaciones puede variar desde 15 °C (o menos) a 30 °C (o más). Las pruebas de sedimentación en tubo se leen normalmente en el transcurso de 1-2 h. Las aglutinaciones fuertes, sin embargo, serán obvias mucho antes. En las pruebas de centrifugación en tubo, la aglutinación puede leerse tras sólo 5-10 min de incubación si la mezcla de células y suero se centrifuga.

Pruebas en placas Debido a la evaporación, las pruebas en placa deben leerse en 5 min. Para determinaciones rápidas del grupo ABO y RhD se usan normalmente reactivos que producen aglutinación fuerte en 1-2 min. Debido a que los resultados se leen macroscópicamente, deberían usarse suspensiones de células concentradas (35-45% de células en su propio suero o plasma).

Lectura de los resultados de las pruebas en tubo Sólo el grado más intenso y completo de aglutinación (C) parece ser capaz de resistir un procedimiento de agitación sin cierto grado de rotura, lo que podría degradar la inten-

sidad de la reacción. Por ello, el BCSH Blood Transfusion Task Force ha recomendado el siguiente procedimiento de lectura40.

Lectura microscópica Es esencial que se siga una técnica cuidadosa y estandarizada. Sacar el tubo cuidadosamente de su gradilla sin alterar el botón de células sedimentadas. Mantener el tubo verticalmente, introducir una pipeta Pasteur, con la punta cortada con un ángulo de 90°. Cuidadosamente retirar una columna de sobrenadante de aproximadamente 1 cm de longitud, y sin introducir ninguna burbuja de aire, retirar una columna de eritrocitos de 1-2 mm, colocando la punta de la pipeta en el botón de eritrocitos. Depositar suavemente el sobrenadante y las células en un portaobjetos sobre un área de 2 × 1 cm. Es importante no sobrecargar la suspensión con células y esto se consigue con el método descrito previamente. En la tabla 19.12 se proporciona un esquema de la puntuación de los resultados.

Lectura macroscópica En el método «macroscópico» se recomienda una suave agitación con inclinación y rotación. Es posible leer macroscópicamente las pruebas de aglutinación con la ayuda de un cristal de lectura manual o un espejo cóncavo, pero entonces resulta difícil distinguir reacciones más débiles que + (lectura microscópica) del aspecto normal, ligeramente granular, de los eritrocitos no aglutinados y en suspensión. Por ello, la lectura macroscópica proporciona valores de titulación inferiores a los de la lectura microscópica, aunque se recomienda la primera. Seguir el sistema de puntuación de la tabla 19.12. A veces puede obtenerse una buena aproximación a la presencia o ausencia de aglutinación por inspección del depósito de células sedimentadas: un botón perfectamente redondeado y liso sugiere ausencia de aglutinación, mientras que la aglutinación produce grados variables de irregularidad, «granularidad» o dispersión del depósito (fig. 19.2).

Demostración de la lisis Muchos anticuerpos contra grupos sanguíneos lisan los eritrocitos, en presencia del complemento, bajo condiciones adecuadas. Esto es particularmente cierto para los antiA y anti-B, anti-P, anti-Lea y Leb, anti-PP1Pk (anti-Tja) y ciertos autoanticuerpos (v. pág. 217). Si se necesita añadir complemento fresco, éste debería mezclarse con el suero problema antes de la adición de los eritrocitos. De no ser así, se produce aglutinación y el acceso al complemento podría bloquearse. La lisis debería valorarse al final del período de incubación, antes de la centrifugación de los tubos, si las células se han sedimentado de manera suficiente; la lisis puede ser valorada semicuantitativamente tras centrifugar las suspensiones y comparando el color del sobrenadante con el control. Si se desea conocer si se ha producido lisis, el volumen final de la suspensión de células y suero tiene que ser mayor de lo que se requiere para la lectura de aglutinación.

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

Tabla 19.12.

Puntuación de los resultados de las pruebas de aglutinación de eritrocitos

Símbolo

Puntuación de la aglutinacióna

Descripción

4 + o C (completa)

12

Botón celular permanece en un grupo, macroscópicamente visible

3+

10

Botón celular dividido en varios grandes grupos, visibles microscópicamente

2+

8

Botón celular dividido en muchos grupos pequeños, visibles macroscópicamente

1+

5

Botón celular dividido en grupos finamente granulares, visibles casi macroscópicamente

(+) o w (débil)

3

Botón celular dividido en finos gránulos, visibles sólo microscópicamenteb

–

0

Resultado negativo, todas las células están sueltas y uniformemente distribuidas

a

La puntuación final es la suma de las puntuaciones de aglutinación para cada dilución. Puede clasificarse adicionalmente, dependiendo del número de células en el grupo (p. ej., grupos de 12-20 células [puntuación 3], 8-10 células [puntuación 2], 4-6 células [puntuación 1]. Ésta es la mínima aglutinación que debería considerarse positiva. b

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Figura 19.2. Aspecto macroscópico de la aglutinación en tubos con fondo redondeado. La aglutinación muestra distintos grados de «granularidad»; en ausencia de aglutinación, las células sedimentadas aparecen como un botón redondeado liso, como en el extremo derecho.

Deberían emplearse tubos (75 × 10 o 12 mm) y el nivel de la suspensión de células y suero debería subir muy por encima de la parte inferior cóncava de los tubos. En las pruebas para actividad lítica puede requerirse una alta concentración de complemento. Por ello, en contraste con las pruebas para aglutinación, tiene ventajas usar una suspensión de eritrocitos más concentrada (aproximadamente un 5%). Las pruebas de lisis se suelen realizar a 37 °C pero, con anticuerpos fríos, podría ser apropiada una temperatura inferior (p. ej., 20 o 30 °C), dependiendo de la amplitud térmica de actividad del anticuerpo o, en el caso del anticuerpo de Donath-Landsteiner, 0 °C seguido de 37 °C (v. pág. 218). Con ciertos anticuerpos el pH de la suspensión de células y suero afecta a la aparición de lisis. Para ellos, el pH óptimo es 6,5-6,8.

Controles Es necesario asegurarse de que la lisis observada no es un artefacto (es decir, que la lisis es producida por el suero problema y no por el suero añadido como complemento) y

que el complemento añadido es potente. Por ello es necesario un control de complemento (no el suero problema), como sería un control usando un suero que contenga anticuerpos líticos. En las pruebas de lisis, debería ponerse gran cuidado en depositar la suspensión celular directamente en el suero. Si la suspensión celular entra en contacto con la superficie del tubo y se empieza a secar, este efecto, por sí solo, conducirá a lisis.

Prueba de antiglobulina La prueba de antiglobulina (prueba de Coombs) fue introducida por Coombs, Mourant y Race en 194541, como un método para detectar anticuerpos anti-Rh «incompletos» (es decir, anticuerpos IgG capaces de sensibilizar a los eritrocitos, pero incapaces de causar aglutinación de las mismas células suspendidas en solución salina) en oposición a los anticuerpos IgM «completos», que aglutinan los eritrocitos suspendidos en solución salina. Pueden realizarse las pruebas de antiglobulina directa e indirecta. En la prueba de antiglobulina directa (PAD), las célu-

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

las del paciente, después de cuidadoso lavado, son analizadas para detectar la sensibilización que ha ocurrido in vivo; en la prueba de antiglobulina indirecta (PAI), los eritrocitos normales son incubados con el suero que se sospecha que contiene un anticuerpo y seguidamente analizadas, después de lavado, para detectar un anticuerpo fijado in vitro. La prueba de antiglobulina es probablemente la prueba más importante del repertorio de las pruebas serológicas. La PAD se emplea para demostrar la unión de anticuerpos a los eritrocitos in vivo, como en la anemia hemolítica autoinmune (v. pág. 211), EHRN aloinmune (v. pág. 464) y la hemólisis aloinmune que sigue a una transfusión incompatible (v. pág. 471). La PAI tiene una extensa aplicación en la serología de la transfusión sanguínea, incluyendo la detección e identificación de anticuerpos y pruebas cruzadas.

Reactivos de antiglobulina Reactivos poliespecíficos (amplio espectro) La mayoría de los anticuerpos de eritrocitos son IgG no fijados a complemento; el anti-IgG es por ello un componente esencial de cualquier reactivo poliespecífico. No se requiere anti-IgA, porque siempre se producen anticuerpos IgG de la misma especificidad en presencia de anticuerpos IgA. Tampoco se requiere anti-IgM, porque los aloanticuerpos IgM clínicamente significativos, que no causan aglutinación en solución salina, son mucho más fácilmente detectados por el complemento al que están unidos. Tradicionalmente, los anticomplemento (llamados antiC3c y anti-C3d) se han considerado también esenciales. Sin embargo, si se usa plasma, sólo es necesario anti-IgG porque el EDTA impide la activación del complemento. Además, parece que la mayoría, si no todos, los anticuerpos detectados por la reacción C3-anti-C3 en pruebas de fuerza iónica normal pueden ser detectados con anti-IgG en polibreno polietilenglicol (PEG) y LISS. Los laboratorios que usan técnicas distintas al NISS han adoptado el uso de anti-IgG solos, apoyados en los cambios de la guía de la AABB en 1990 y del BCSH en 1996. Sin embargo, la guía de la BCSH hace hincapié en la importancia de haber hecho una detección de células con expresión homocigota de JKa antes de decidir usar anti-IgG en vez de un reactivo antiglobulina poliespecífico. Para el diagnóstico de la anemia hemolítica autoinmune sí se requiere anti-C3 en las PAD.

Reactivos monoespecíficos Los reactivos monoespecíficos pueden prepararse contra las cadenas pesadas de IgG, IgM e IgA y se conocen como anti-γ, anti-μ y anti-α; también se dispone de anticuerpos contra las subclases de IgG. Los anticuerpos específicos contra los componentes del complemento C4 y C3 y productos de degradación de C3 pueden prepararse como se mencionó previamente. La principal aplicación clínica de estos reactivos monoespecíficos es definir las características inmunoquímicas de los anticuerpos. Esto es relevante para el mecanismo de la destrucción celular in vivo, y en el caso de IgG, las subclases tienen diferentes propiedades biológicas (v. pág. 424).

Control de calidad de los reactivos antiglobulina El control de calidad de los reactivos antiglobulina debe siempre realizarse mediante la técnica exacta para la que se emplean. Todos los reactivos deberían utilizarse según las instrucciones del fabricante, a menos que se hayan estandarizado adecuadamente para otros métodos. Para evaluar tanto los reactivos poliespecíficos antiglobulina humana como aquellos que contienen sus componentes monoespecíficos separados, existe un reactivo de referencia del ISBT/ICSH en polvo congelado28. La validación de un nuevo reactivo antiglobulina debería valorar las siguientes cualidades de los reactivos: 1. Especificidad. Los reactivos deberían sólo aglutinar eritrocitos sensibilizados con anticuerpos y/o cubiertos con niveles significativos de componentes del complemento. 2. Potencia del anti-IgG por titulación serológica. 3. Especificidad y potencia de los anticuerpos anticomplemento. Un reactivo poliespecífico debería contener antiC3c y anti-C3d a niveles controlados para evitar reacciones falso positivo o un anti-C3d monoclonal potente apropiado (p. ej., BRIC-8). Debería contener poco o ningún anti-C4. Para valorar estas cualidades se requieren eritrocitos específicamente recubiertos con C3b, Cb3i, C3d y C4. Un grupo de trabajo del ISBT/ICSH ha publicado detalles de los procedimientos recomendados para la preparación de estas células42. Se reconoce que algunos bancos de sangre de los hospitales sean incapaces de evaluar un reactivo antiglobulina tan exhaustivamente como resumimos previamente. Sin embargo, deberían cumplir los siguientes requisitos mínimos de todos los nuevos reactivos antiglobulina: 1. Probar el reactivo antiglobulina para asegurar la ausencia de resultados falsos positivos simulando las pruebas cruzadas. a) Probar si hay un exceso de anti-C3d incubando suero fresco a 37 °C mediante las pruebas de NISS y LISS con 6 células ABO-compatibles de muestras de un donante CPD-A1 (10-30 días de antigüedad). Ésta es una prueba crítica para los resultados falsos positivos debidos a consumo de C3d en la sangre almacenada, que aumenta aún más con la incubación con suero fresco. b) Las pruebas para contaminación con anticuerpos de eritrocitos (contra células A1, B y O lavadas) deben ser negativas. Continuar el proceso sólo si los reactivos antiglobulina han pasado las pruebas enumeradas previamente. 2. Comparar el reactivo antiglobulina con el reactivo usado actualmente, empleando una selección de anticuerpos débiles. Estos anticuerpos deben ser seleccionados de aquellos encontrados en el trabajo rutinario o pueden obtenerse de un centro de transfusión o laboratorio de referencia. Conservar dichos anticuerpos en pequeños volúmenes a 4 °C para pruebas repetidas.

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

3. Diluir un anti-D IgG débil (0,8 UI/ml), como el usado para controles de la prueba de antiglobulina rutinaria, desde no diluido (neto) a una dilución 1:16 y eritrocitos R1r sensibilizados con cada dilución de anti-D. Estas células sensibilizadas (lavadas cuatro veces) deberían ser evaluadas con diluciones ordenadas de 1 a 8 de los reactivos de antiglobulina. Los reactivos antiglobulina deberían no mostrar prozonas en las pruebas de centrifugación inmediata usando 2 volúmenes de antiglobulina por prueba. La potencia de la antiglobulina probada debería al menos igualar al actual reactivo antiglobulina. El reactivo antiglobulina de referencia del ISBT/ICSH puede ser usado para calibrar un reactivo antiglobulina «casero» y puede emplearse como un estándar rutinario. El control de calidad de los reactivos antiglobulinas específicos de clase y subclase de Ig es más complejo, aun siguiendo los principios generales previamente enumerados. Los detalles de las técnicas apropiadas están fuera del alcance de este capítulo; los lectores deberían consultar la revisión de Engelfriet y cols.43.

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Procedimiento recomendado de la prueba de antiglobulina Para la prueba de antiglobulina indirecta rutinaria se recomienda una técnica de centrifugación en tubo; el procedimiento que se describe aquí se basa en las Guidelines for Compatibility Testing in Hospital Blood Banks del BCSH26,40. La ejecución fiable se basa en el procedimiento correcto de cada fase de la prueba y en medidas de calidad y control apropiadas. Las pruebas deberían realizarse en tubos de vidrio (75 × 10 o 12 mm). No se recomiendan tubos de plástico porque pueden absorber IgG, que podrían neutralizar las anti-IgG del reactivo antiglobulina. 1. Eritrocitos sensibilizados (no relevantes para la prueba directa) usando las siguientes proporciones suero:célula: a) Para el NISS, usar al menos 2 volúmenes de suero (preferiblemente 4) y un volumen de suspensión de eritrocitos al 3% lavados (3 veces) y suspendidos en PBS o NaCl a 0,15 mol/l (v. pág. 588). b) Para el LISS, usar 2 volúmenes de suero y 2 volúmenes de suspensión de eritrocitos al 1,5% lavados dos veces en PBS o NaCl a 0,15 mol/l y lavados una vez en LISS y posteriormente suspendidos en LISS (v. pág. 588). c) Para soluciones comerciales de aditivos de baja fuerza iónica, deben seguirse las instrucciones del fabricante. Dado que el volumen de «una gota» varía según el tipo de pipeta o frasco con cuentagotas, debería emplearse un volumen de gota conocido para asegurar que se mantiene una proporción adecuada de suero:células. Mezclar los reactantes agitándolos e incubar a 37 °C, preferiblemente en un baño de agua por un período mínimo de 15 min para la prueba en LISS y de 45 min para la prueba en NISS.

2. Lavar las células que se van a evaluar 4 veces con un mínimo de 3 ml de solución salina por lavado. Se necesita una inyección vigorosa de la solución salina para resuspender las células y conseguir una mezcla adecuada. Debería retirarse todo el sobrenadante posible tras cada lavado, para conseguir una dilución máxima del suero residual. 3. Añadir 2 volúmenes de un reactivo antiglobulina adecuado a cada tubo de la prueba y centrifugar justo después de mezclar concienzudamente. Las combinaciones de fuerzas centrífugas (FC) y el tiempo para la prueba de centrifugación en tubo son las siguientes: FC (g) Tiempo (s)

100 60

200-220 25-30

500 15

1.000 8-10

4. Leer la aglutinación como se describió previamente (v. pág. 428). 5. El control de calidad de las pruebas debería ser monitorizado de la siguiente manera: a) Como control positivo, una IgG anti-D diluida para dar reacciones 1+ o 2+ con células RhD-positivas (R1r). b) Como control negativo, un suero con grupo AB inerte con las mismas células RhD positivas; no es esencial porque la mayoría de las pruebas son negativas. c) La adición de células sensibilizadas a todas las pruebas negativas. Esto es generalmente usado para detectar la neutralización del reactivo antiglobulina debida a la incompleta eliminación del suero en los pasos de lavado. El valor como control de esta prueba depende de la fuerza de la reacción de las células sensibilizadas. Las células control adecuadas sensibilizadas con IgG anti-D deberían dar una reacción 3+ cuando se analizan directamente con el reactivo antiglobulina y deberían mantenerse positivas (si el reactivo es potente) cuando se añade a pruebas negativas pero degradadas (1+ o 2+) debido al efecto de «células agrupadas» de las células no sensibilizadas. La reacción, por supuesto, será negativa si la antiglobulina ha sido neutralizada por el suero residual. La producción de células para servir de control de antiglobulinas satisfactorias40 puede conseguirse limitando el nivel de sensibilización anti-D a aquel que da una prueba negativa en presencia de suero en solución salina en proporción 1:1.000. La idoneidad de las células control de antiglobulinas puede ser evaluada de la siguiente manera: • Preparar dos tubos (10 × 75 mm) con 1 volumen de células no sensibilizadas al 3%; lavar cuatro veces. • Añadir 2 volúmenes de antiglobulina a cada tubo, mezclar bien, centrifugar y leer los tubos para confirmar que la prueba sea negativa. • Añadir 1 volumen de suero en solución salina 1:1.000 en un tubo y 1 volumen de solución salina como control en otro tubo. Mezclar e incubar durante 1 min a temperatura ambiente. • Añadir 1 volumen de células control a cada tubo, mezclar, centrifugar y leer las pruebas.

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

La prueba que contiene suero en solución salina 1:1.000 debería ser negativa, y el tubo control debería dar al menos una reacción 2+. Una reacción negativa con el tubo control sugiere un lavado deficiente y exige corrección del mismo. Si se emplea una centrífuga con lavado celular automático, la eficiencia del lavado debería comprobarse; véase el control de calidad de las centrífugas lavadoras de células32,40.

Tecnología alternativa para la detección de anticuerpos por la prueba de antiglobulina Han surgido técnicas alternativas que tienen una fase de lectura más simple que la lectura manual de la PAI en tubo con centrifugación. Hay dos tipos principales: los métodos de adherencia de eritrocitos en fase sólida44 y las técnicas de aglutinación en columnas. La PAI en tubo con centrifugación es el estándar contra el que cualquier nuevo sistema debería ser comparado. Los métodos de adherencia de los eritrocitos en fase sólida incluyen sistemas en que eritrocitos de fenotipos conocidos, que pueden también estar sensibilizados, son inmovilizados sobre una matriz sólida. En el método referido se preparan placas con tipajes ABO y RhD inmovilizando eritrocitos A1, B y RhD positivos a tiras químicamente modificadas con fondo en U. Las células son posteriormente expuestas al anticuerpo apropiado y las monocapas de eritrocitos sensibilizados desecadas. Se añaden las células problema desconocidas y las placas son centrifugadas tras incubación. En una reacción positiva, las células se extienden sobre la superficie del pocillo porque se han adherido al anticuerpo fijado. En una reacción negativa, no hay adherencia y las células forman un pequeño botón en el centro del pocillo cuando se centrifugan las placas. Para la determinación inversa del grupo sanguíneo y la detección de anticuerpos, se preparan y desecan monocapas de células de detección A1, B y O. Se añade el suero problema y si tiene anticuerpos frente a cualquiera de los antígenos inmovilizados, éstos se unen a la monocapa. Las pruebas se leen tras la adición de células A1B unidas a anti-IgG. Los métodos en fase sólida son muy apropiados para la lectura automática mediante el paso de un rayo de luz a través del pocillo, que no será interrumpido por el botón de células en una prueba negativa, pero será dispersado por la capa de eritrocitos extendida en el pocillo en una prueba positiva. En las técnicas de aglutinación en columna se mezclan volúmenes muy pequeños de suero y células en un reservorio en la parte superior de una estrecha columna que contiene gel de Dextranoa o esferas de cristal b. Las columnas con un reservorio integrado son suministradas en forma de tarjeta o casete, respectivamente. Después de un adecuado período de incubación, las tarjetas/casettes que contienen las pruebas son centrifugadas en una centrífuga en la que el eje de la columna esté exactamente en línea

a b

DiaMed, AG, Suiza. Bio Vue, Ortho-Clinical Diagnostics, Nueva Jersey.

con la fuerza centrífuga. Los eritrocitos, pero no el medio en el que están suspendidos, entran en la columna. Los eritrocitos aglutinados son atrapados en la parte alta de la columna y los no aglutinados forman una pastilla en la parte inferior de la columna (v. fig. 20.5, pág. 454). Las columnas pueden contener también un reactivo antiglobulina para realizar las PAI o PAD. Los eritrocitos no tienen que ser lavados antes de entrar en contacto con el reactivo antiglobulina, debido a que durante la centrifugación sólo pasan a través del gel los eritrocitos y no el líquido de suspensión. Las columnas pueden también incluir un anticuerpo (p. ej., anti-D) para la determinación del grupo sanguíneo. Las células antígeno positivas son aglutinadas y atrapadas en la porción superior de la columna. Las ventajas de la tecnología de aglutinación en columna son las siguientes: 1. Facilidad de uso y lectura; teóricamente puede ser realizada por personal relativamente poco entrenado. 2. Menor posibilidad de contaminación por aerosol de las muestras infectadas, debido a la ausencia de lavado celular antes de las PAI. 3. Las tarjetas pueden guardarse hasta 24 h, y es posible la revisión de los resultados por personal experimentado. 4. Facilidad de automatización e identificación positiva de las muestras. Sin embargo, esta tecnología es cara y su realización en manos experimentadas no siempre es comparativamente mejor que el estándar PAI-LISS.

Valoración del rendimiento del trabajador individual Se recomienda que todo el personal (incluido el personal de guardia que no trabaje rutinariamente en el banco de sangre) sea evaluado a intervalos regulares. Para este propósito puede emplearse un procedimiento basado en la repetición «ciega» de pruebas de antiglobulinas33,40. El procedimiento es el siguiente: 1. Titular una IgG anti-D de título bajo (8-16), como la usada para el control de la prueba de la antiglobulina, contra células RhD-positivas OR1r o para encontrar la dilución de anti-D que proporciona células sensibilizadas 1+ o 2+ (la mayoría de centros usan alrededor de 0,3 UI/ml). Para este propósito existe un reactivo de referencia anti-D estándar del BCSH–NIBSC (95/784)46 (disponible en el NIBSC [v. pág. 591]). 2. Preparar un lote de células sensibilizadas (p. ej., incubando 16 ml de la dilución anti-D seleccionada con 8 ml de eritrocitos lavados OR1 al 3% a 37 °C durante 45 min). 3. Etiquetar doce tubos para pruebas para realizar a ciegas por otra persona. Colocar un volumen de células al 3% sensibilizadas 1+ o 2+ y 2 volúmenes de suero inerte del grupo AB (para simular el volumen de suero usado en las pruebas rutinarias) en 9 tubos aleatorios, y seguidamente en los tubos restantes poner 1 volumen de células no sensibilizadas con 2 volúmenes de suero inerte del grupo AB. Anotar la posición de varias pruebas.

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

4. Lavar las células minuciosamente cuatro veces, añadir antiglobulina y centrifugar; leer a continuación los tubos. 5. Registrar el número de resultados falsos negativos (y falsos positivos) para cada operario y analizar en relación con la lectura o técnica de lavado. Es aconsejable dar clases inmediatas a cualquier operario con fallos en las pruebas de lavado o lectura, seguido de más análisis de repetición «ciega» para demostrar la mejoría en los procedimientos y restablecer la autoconfianza.

Titulación de anticuerpos En la figura 19.3, se ilustra un método para preparar diluciones primarias de suero y llevar a cabo la posterior titulación de anticuerpos. Los ejercicios de valoración de la calidad externos han demostrado el amplio intervalo de títulos obtenidos de una única muestra, reflejo de las diferentes sensibilidades de las tecnologías utilizadas, y también han destacado la falta de reproducibilidad47. Los puntos siguientes se han tomado de un apéndice de la guía del BCSH48.

Preparación de diluciones seriadas de suero del paciente u otro suero 1. Todas las diluciones o titulaciones deberían hacerse usando pipetas calibradas con puntas diferentes para cada paso. 2. El diluyente debería ser solución salina tamponada a pH 7,0 para las pruebas de aglutinación; para las pruebas de lisis, el suero humano fresco normal ABO compatible no diluido debería acidificarse para que el pH de la mezcla de células y suero fuera de 6,8. El suero normal sirve como fuente de complemento. 3. El tamaño de los tubos y los volúmenes de análisis deberían ser escogidos para permitir una meticulosa mezcla de las diluciones.

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Dilución de suero

1 en 1

Adición de suspensiones de eritrocitos a diluciones del suero Es convencional añadir 1 volumen de suspensión de eritrocitos a 1 volumen de suero o dilución de suero. Esto quiere decir que cada dilución de anticuerpos, y por ello el título «final», será el doble que la dilución del suero original. Debido a que la expresión de antígenos de los eritrocitos varía con la fuente y el tiempo de la muestra, siempre que sea posible debe usarse la misma muestra celular.

Prueba para la secreción de sustancia ABH En la mayoría de la población se encuentran muchas distribuciones de sustancias con actividad antigénica apropiada A, B y H, en saliva y todos los fluidos corporales, controladas por un gen regulador secretor (Se), que se hereda independientemente de los genes ABH. Sólo alrededor del 20% de las personas son no secretoras. El estatus secretor individual puede ser determinado por análisis de la saliva.

Método Diluir un suero anti-A o anti-B de manera que se obtenga una aglutinación bien visible con células A2 o B tras una

1 en 4

1 en 16

1 en 64

15 5

15 5

15 5

15 5

15 5

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

Solución salina o suero normal

Figura 19.3. Diagrama que ilustra el método de preparación de cuatro series de cuatro diluciones de un suero. Los círculos grandes en la parte superior representan los tubos grandes en los que se hace la primera dilución; los círculos más pequeños representan los tubos en que se realizan las titulaciones. Los números representan gotas o volúmenes. El suero no diluido está indicado en negrita.

4. Cuando se analicen muestras con títulos altos, debería hacerse una dilución inicial para reducir el número de duplicación doble progresiva a menos de 10. Debería escogerse un intervalo suficiente de diluciones para asegurar que pueden observarse dos resultados negativos. 5. El criterio de valoración debería ser macroscópico y bien definido. Cuando sea posible, debe considerarse el uso de ayudas para la comparación visual. 6. Cuando sea posible cada muestra debería ser analizada en paralelo con la muestra previa. 7. Las titulaciones deberían repetirse si existen diferencias en más de un tubo en los títulos obtenidos de las muestras secuenciales.

1 1 Control en 256 en 1.024

Suero del paciente

Solución salina o suero normal 3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

433

434

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

hora a temperatura ambiente (p. ej., si el título de anticuerpos es 128, emplear una dilución 1:16). Recoger varios mililitros de saliva en tubos de centrifugación. Colocar el tubo en agua hirviendo durante 10 min y después centrifugar. Hacer diluciones seriadas del sobrenadante en solución salina para conseguir diluciones entre 1:2 y 1:32. Usar un tubo sólo con saliva como control. Añadir un volumen igual del suero diluido anti-A (o antiB) a cada tubo y tras agitación de la gradilla de tubos, mantenerlos a temperatura ambiente durante 10-15 min. Seguidamente, añadir un volumen igual de una suspensión de A2 (o B) al 2% en solución salina en cada tubo. Mezclar los contenidos y mantener a temperatura ambiente durante 1-2 h; entonces valorar si se ha producido aglutinación. Si la saliva contiene sustancias A o B, la aglutinación normalmente se inhibe en todos los tubos excepto en el tubo de solución salina control. La presencia de sustancia H puede demostrarse de manera similar usando un extracto de Ulex, suero de anguila, o el anticuerpo frío «incompleto» que se produce de forma natural como fuente de anti-H.

PLAQUETAS Y GRANULOCITOS

Sistemas aloantigénicos de plaquetas y granulocitos Los aloantígenos de las plaquetas y los granulocitos pueden ser exclusivos de cada tipo celular (específico de célula) o compartidos con otras células. Los antígenos plaquetarios humanos (HPA) y los antígenos de neutrófilos humanos (HNA), actualmente reconocidos, se recogen en las tablas 19.13 a 19.1549-51. La nomenclatura histórica para los antígenos de los granulocitos utilizaba la letra N para indicar especificidad neutrofílica, y ésta se ha mantenido así, aunque se reconoce que muchos estudios usan granulocitos más que neutrófilos puros y muchos anticuerpos «específicos de neutrófilos» pueden también dirigirse contra precursores de granulocitos. En la nomenclatura de los HPA, se designaron HPA-1, -2, -3, -4 y -5 como sistemas aloantigénicos separados dialélicos. Los alelos de alta frecuencia de un sistema se designaron con la letra a y los alelos de baja frecuencia, con la letra b. Sin embargo, este sistema es difícil de reconciliar con el conocimiento de genética molecular actual, que sugiere que cada nuevo cambio de base no constituye un nuevo sistema aloantigénico dialélico, sino que define un alelo simple que expresa un nuevo epítopo simple. Actualmente, se han encontrado ocho alelos GPIIIa diferentes en los genes humanos, se han descrito tres variantes alélicas para GPIa y GPIIb y dos variantes alélicas para las subunidades GPIbα y GPIbβ. La página web del NIBSC (www.nibsc.ac.uk) dispone de una base de antígenos plaquetarios humanos. De los antígenos compartidos, el sistema HLA es el más importante clínicamente; sólo los antígenos de clase 1 (HLA-A, -B y en menor extensión -C) se expresan en las plaquetas y en los

granulocitos. Los antígenos ABH se expresan también en las plaquetas (en parte, absorbidos del plasma) pero no pueden ser demostrados en los granulocitos.

Significado clínico de los anticuerpos de plaquetas y granulocitos Los anticuerpos de las plaquetas y los granulocitos pueden ser clasificados de acuerdo con el estímulo antigénico (p. ej., alo-, iso-, auto- y anticuerpos inducidos por drogas).

Aloanticuerpos La aloinmunización frente a antígenos de plaquetas y granulocitos es la mayoría de las veces consecuencia de una transfusión o embarazo. Los problemas clínicos asociados dependen de la especificidad del anticuerpo, que determina la célula diana implicada. Los aloanticuerpos específicos de una célula se asocian con condiciones clínicas bien definidas, que se resumen en las tablas 19.16 y 19.17. La trombocitopenia aloinmune fetal y neonatal suele deberse a anti-HPA-1a y con menos frecuencia a anti-HPA5b. La posibilidad de aloinmunización HPA-1a está fuertemente asociada con los HLA maternos de la clase–II tipo DRB3*0101 (DR52a)52. A las parejas se les debería ofrecer la realización del genotipo HPA, y si se es heterocigoto, con un hijo anterior gravemente afectado, debería considerarse la determinación del grupo HPA fetal en el primer trimestre del embarazo de la siguiente gestación usando el ADN de los amniocitos. Existen algunas pruebas de que la trombocitopenia grave se asocia con un título de anti-HPA-1a mayor de 32 en el tercer trimestre, empleando inmovilización con anticuerpos monoclonales de los antígenos plaquetarios (MAIPA)53 (v. más adelante). En varias publicaciones se discuten estrategias potenciales para la detección rutinaria antenatal y la aceptabilidad y relación coste-efectividad de tales programas53,54. La púrpura postransfusional está causada con más frecuencia por anti-HPA-1a, pero puede estar asociada con anticuerpos anti-APH de otras especificidades contra HPA1b, HPA-2b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a y HPA-5b55. La refractariedad inmunológica a las transfusiones plaquetarias suele deberse a anticuerpos anti-HLA. Sin embargo, en pacientes multitransfundidos con inmunización HLA, hasta el 25% pueden tener también anticuerpos antiHPA56,57.

Isoanticuerpos En raras ocasiones, tras transfusiones sanguíneas o embarazo, los pacientes con enfermedad de Glanzmann tipo I forman anticuerpos que reaccionan con glucoproteínas plaquetarias (GP) IIb/IIIa no presentes en sus propias plaquetas, pero sí en plaquetas normales (es decir, determinantes isotípicos)58-61. De manera similar, los pacientes con síndrome de Bernard–Soulier pueden formar anticuerpos contra determinantes isotípicas en GP Ib/V/IX no presentes en sus propias plaquetas62. Esto puede representar un grave problema clínico, porque podrían no encontrarse plaquetas compatibles para tratar episodios graves de sangrado.

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

Tabla 19.13.

Genética molecular de los antígenos plaquetarios humanos (HPA)

Antígeno

Sinónimo de localización

Sustitución de glucoproteína

Sustitución de nucleótido

Aminoácido

HPA-1a

Zwa, PlA1

GPIIIa

T196

Leu33

HPA-1b

Zwb, PlA2

C196

Pro33

C524

Thr145

T524

Met145

T2.622

Ile843

G2.622

Ser843

G526

Arg143

A526

Gln143

G1.648

Glu505

A1.648

Lys505

GPIIIa

A1.564 G1.564

Gln489 Arg489

HPA-2a

Ko

b

GPIbα

a

a

HPA-2b

Ko Sib

HPA-3a

Baka, Leka

HPA-3b

Bakb

HPA-4a

b

a

a

b

Yuk , Pen

HPA-4b

Yuk , Pen

HPA-5a

Brb, Zavb

HPA-5b

Bra, Zava, Hca a

a

GPIIb

GPIIIa

GPIa

HPA-6bW

Ca , Tu

HPA-7bW

Moa

GPIIIa

G1.317 C1.317

Ala407 Pro407

HPA-8bW

Sra

GPIIIa

T2.004 C2.004

Cys636 Arg636

HPA-9bW

Maxa

GPIIb

A2.603 G2.603

Met837 Val837

HPA-10bW

Laa

GPIIIa

A281 G281

Gln62 Arg62

HPA-11bW

Groa

GPIIIa

A1.996 G1.996

His633 Arg633

HPA-12bW

Iya

GPIbβ

A141 G141

Glu15 Gly15

HPA-13bW

Sita

GPIa

T2.531 C2.531

Met799 Thr799

HPA-15a

Govb

CD109

C2.108

Ser703

HPA-15b

Gova

CD109

A2.108

Tyr703

HPA-

Oea

GPIIIa

HPA-

Vaa

GPIIIa

HPA-

a

GPIbα

Pe

© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

GP, localización de los epítopos en la glucoproteína; HPA, antígenos plaquetarios humanos.

Autoanticuerpos La trombocitopenia autoinmune puede ser idiopática o secundaria asociada con otras condiciones. La demostración de un autoanticuerpo plaquetario no es un requisito; incluso con las técnicas más adecuadas disponibles actualmente, los autoanticuerpos plaquetarios son difíciles de demostrar en una proporción variable de pacientes (10-20%). Los anticuerpos autorreactivos se dirigen contra epítopos de ciertas glucoproteínas. En el 30-40% de los pacientes se dirigen directamente contra epítopos del heterodímero de la

integrina αIIbβ3, la glucoproteína plaquetaria (GP) IIb/IIIa (CD41) y en el 30-40% contra el receptor del factor Von Willebrand o el complejo GpIbα/GPIbβ/IX (CD42)63-66. En el diagnóstico de trombocitopenia autoinmune es importante considerar y excluir otras tres condiciones inmunológicas: 1. Púrpura postransfusional (PTP). Esta posibilidad viene sugerida por el antecedente de una transfusión en las 2 semanas previas55.

435

436

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tabla 19.14.

Frecuencias de los antígenos plaquetarios humanos (%) en diferentes poblaciones

Antígeno

Holandesa

Finlandesa

Caucásica americana

Japonesa

Coreana

HPA-1a

97,9

99,0

98,0

100,0

99,5

HPA-1b

28,8

26,5

20,0

0,3

2,0

HPA-2a

100,0

99,0

97,0

99,2

99,0

HPA-2b

13,5

16,5

15,0

19,7

14,0

HPA-3a

81,0

83,5

88,0

85,1

82,5

HPA-3b

69,8

66,5

54,0

66,2

71,5

HPA-4a

100,0

100,0

100,0

100,0

HPA-4b

0,0

0,0

2,0

2,0

HPA-5a

100,0

99,5

98,0

99,0

100,0

HPA-5b

19,7

10,0

21,0

7,0

4,5

HPA-6a

100,0

99,7

100,0

HPA-6b

2,4

4,8

4,0

Tabla 19.15.

Sistema de antígenos de neutrófilos humanos

Sistema antigénico

Fenotipo antigénico

Localización

Acrónimo

Frecuencia en caucásicos (%)

HNA-1

HNA-1a HNA-1b HNA-1c

FcγRIIIb FcγRIIIb FcγRIIIb

NA1 NA2 SH

58 88 5

HNA-2

HNA-2a

gp50–64

NB1

97

HNA-3

HNA-3a

gp70–95

5b

97

HNA-4

HNA-4a

CD11b

MART

99

HNA-5

HNA-5a

CD11a

OND

96

HNA, antígenos de neutrófilos humanos.

2. Trombocitopenia inmune inducida por fármacos. Es esencial la historia de los fármacos administrados al paciente. La trombocitopenia inducida por heparina (TIH) es la causa más frecuente de trombocitopenia inducida por fármacos y puede ser confirmada por la demostración mediante ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) de complejos de anticuerpos frente a heparina y factor plaquetario 4 (FP4)67. 3. Seudotrombocitopenia. El paciente tiene un anticuerpo plaquetario dependiente de EDTA que es activo sólo in vitro. El anticuerpo (IgG y/o IgM) reacciona con antígenos ocultos (crípticos) en las GP IIb/IIIa, que quedan expuestos debido a cambios conformacionales en el complejo causados por la eliminación de Ca2+ por el EDTA68. Los anticuerpos causan aglutinación de las plaquetas en la muestra de sangre con EDTA, y en el frotis sanguíneo aparecen agregados plaquetarios o «satelitismo» plaquetario alrededor de los neutrófilos, lo que conduce en ambos casos a un recuento plaquetario falsamente disminuido. Para evitar esto, la sangre debería obtenerse en tubos con citrato.

La neutropenia autoinmune puede ser idiopática o secundaria. La neutropenia idiopática autoinmune es más frecuente en niños que en adultos, en los que habitualmente se asocia con otros trastornos que tienen en común un desequilibrio del sistema inmune69. Sin embargo, es la menos estudiada de las citopenias autoinmunes, porque es poco frecuente y por el hecho de que realizar análisis con granulocitos es difícil, largo, muy laborioso y caro. Los anticuerpos antigranulocitos (normalmente IgG) son inusuales dado que a menudo tienen especificidades bien definidas para aloantígenos, especialmente NA1 o NA270. Estos autoanticuerpos pueden suprimir los precursores de granulocitos en la médula ósea y causar neutropenia grave. Los estudios ante una sospecha de neutropenia autoinmune deberían, siempre que sea posible, incluir el estudio inmunológico de los granulocitos y un análisis de clonalidad (p. ej., CFU-GM) de los precursores de la médula ósea como células diana.

Anticuerpos inducidos por fármacos Los anticuerpos inducidos por fármacos pueden causar anemia hemolítica (v. pág. 218), trombocitopenia o neutro-

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

Tabla 19.16. Significado clínico de los aloanticuerpos específicos de plaquetas80 1. Trombocitopenia aloinmune neonatal 2. Púrpura postransfusional

Técnica

1989 1992 1995 1998

3. Refractariedad a transfusión de plaquetas. Usualmente debida a anticuerpos frente a los antígenos de los leucocitos

PIFT microscopio

5

4

1

2

PIFT citometría de flujo

3

5

5

7

ELISA

5

2

0

0

Tabla 19.17. Significado clínico de los aloanticuerpos específicos de granulocitos112–114

SPRCA

3

5

10

8

1. Neutropenia aloinmune neonatal

Eliminación de HLA con cloroquina o ácido

3

12

11

9

2. Reacción febril postransfusional (también implicados anticuerpos HLA)

Western blot

3

1

0

0

MAIPA o MACE

0

4

4

6

Panel de genotipos basado en ADN

0

0

7

8

N.º de participantes

14

17

15

14

3. Lesión pulmonar aguda relacionado con la transfusión (TRALI) (transfusión de títulos elevados de anticuerpo) 4. Corta supervivencia y mala funcionalidad de los granulocitos transfundidos (también implicados los anticuerpos HLA) 5. Neutropenia autoinmune; algunos anticuerpos tienen aloespecificidad para antígenos del sistema HNA HLA, antígeno leucocitario humano; HNA, antígeno de neutrófilos humano.

penia selectivas, o varias combinaciones de éstas en el mismo paciente71,72. Un fármaco puede causar una citopenia inmune por estimulación de la producción tanto de un autoanticuerpo (que reacciona directamente con la célula diana independientemente del fármaco en sí mismo) como de un anticuerpo dependiente de un fármaco (que destruye la célula diana por reacción de un complejo fármaco-membrana en la célula diana)73. Las pruebas de laboratorio pueden demostrar ambos tipos de anticuerpos en algunos pacientes74.

Demostración de anticuerpos de plaquetas y de granulocitos

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Tabla 19.18. Cambios en el número de participantes en reuniones que emplean varias técnicas inmunológicas de plaquetas en los Australasian Platelet Workshops entre 1989 y 199875

No hay un método único que detecte por igual todos los tipos de anticuerpos plaquetarios y granulocíticos. En la práctica, es útil tener un método básico de detección que detecte la mayoría de los anticuerpos que normalmente se producen, tanto ligados a la célula (prueba directa) como en suero (prueba indirecta), y complementarlo con otros métodos seleccionados para demostrar propiedades particulares de un anticuerpo y para medir la cantidad de anticuerpo fijado a la célula. En la tabla 19.18 se muestran las distintas técnicas usadas en la última década por los participantes en los Australasian Platelet Workshops75.

Aloanticuerpos Las publicaciones de las reuniones nacionales e internacionales hacen posible realizar una guía para las pruebas inmunológicas plaquetarias. Los procedimientos básicos para

ELISA, análisis de inmunoabsorción ligada a enzima; MACE, captura de antígenos modificada; MAIPA, inmovilización con anticuerpos monoclonales de los antígenos plaquetarios; PIFT, prueba de inmunofluorescencia plaquetaria; SPRCA, adherencia eritrocitos en fase sólida.

demostrar los aloanticuerpos plaquetarios deberían incluir los siguientes: 1. Prueba de plaquetas para anticuerpos reactivos con plaquetas. La reunión de trabajo del ISBT/ICSH sobre serología plaquetaria76 recomendaba como estándar para la evaluación de otras técnicas de anticuerpos plaquetarios la prueba de inmunofluorescencia de suspensión plaquetaria77. Es importante combinar un análisis sensible para detectar fijación, tal como la prueba de inmunofluorescencia plaquetaria (PIFT), con un método de captura del antígeno, como el MAIPA78, para incrementar las posibilidades de detectar anticuerpos débiles o aquellos que reaccionan con relativamente pocos lugares antigénicos. 2. Prueba de linfocitos para detectar anticuerpos HLA. Dado que los anticuerpos HLA también reaccionan con plaquetas, en el procedimiento de detección de anticuerpos básico, deberían incluirse análisis de citotoxicidad de linfocitos y/o ELISA. 3. Pruebas para diferenciar anticuerpos específicos plaquetarios de los HLA. La técnica de MAIPA que emplea anticuerpos monoclonales apropiados es particularmente útil para separar muestras de anticuerpos reactivos con plaquetas (v. pág. 443). La técnica de «denudado» con cloroquina para inactivar las moléculas HLA de clase I en las plaquetas79 es también útil a este respecto (v. pág. 442). Las técnicas convencionales serológicas (p. ej., reacciones diferenciales con un panel de plaquetas y linfocitos normales; absorción diferencial de anti-

437

438

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

cuerpos HLA, etc.) pueden también utilizarse para diferenciar anticuerpos específicos de célula y HLA, pero son menos útiles para la detección rápida que la técnica de «denudado» con cloroquina. La caracterización adicional de los anticuerpos específicos plaquetarios requerirá remitirlos a un laboratorio de referencia. La identificación de especificidades alogénicas debería hacerse, como con los anticuerpos de eritrocitos, mediante reacción con un panel de genotipos seleccionados de plaquetas del grupo O, preferiblemente con referencia al genotipo plaquetario del paciente. Una importante consideración en la serología plaquetaria es la existencia ocasional de anticuerpos contra antígenos ocultos (crípticos) del complejo GP IIb/IIIa, que quedan expuestos por fijación con EDTA y paraformaldehído (PFA)80. Estos anticuerpos, que son activos sólo in vitro, son impredecibles, pero cuando se sospeche su existencia, pueden evitarse usando pruebas con plaquetas no fijadas de sangre recogida con citrato. La detección e identificación de los aloanticuerpos de los granulocitos deberían ser reservadas para laboratorios de referencia con experiencia, pero deberían seguir un esquema similar con el uso de inmovilización de anticuerpos monoclonales de antígenos de granulocitos (MAIGA)81,82 o adsorción del suero con muestras de plaquetas para diferenciar entre anticuerpos específicos de los granulocitos y HLA.

Autoanticuerpos La detección de autoanticuerpos y anticuerpos inducidos por fármacos requiere una consideración especial. Cuando se buscan autoanticuerpos plaquetarios (o antigranulocitos), puede llevar a errores probar el suero del paciente sólo contra plaquetas (granulocitos) normales, porque por la presencia de aloanticuerpos (p. ej., HLA o específicos de célula) inducidos por transfusiones previas o embarazos pueden producirse reacciones positivas. Es importante demostrar que un autoanticuerpo del suero del paciente reacciona con las células propias del paciente. Idealmente, debería realizarse un PAD (p. ej., PIFT), antes de realizar el tratamiento, para el anticuerpo fijado in vivo. Cuando existe una citopenia grave, puede ser imposible obtener suficientes células para la prueba; sin embargo, las muestras de suero deberían almacenarse a –20 °C y ser probadas retrospectivamente contra las células del paciente cuando el recuento plaquetario (o de neutrófilos) periférico se haya incrementado como respuesta al tratamiento. De más interés en la autoinmunidad plaquetaria ha sido la medición cuantitativa de las inmunoglobinas asociadas a plaquetas como un indicador de sensibilización in vivo. Una crítica de estos métodos cuantitativos es que detectan no sólo anticuerpos plaquetarios, sino también Ig no específicamente atrapadas o fijadas a las plaquetas y fragmentos plaquetarios83 y, por ello, generalmente no son específicas en el diagnóstico de trombocitopenia autoinmune84. Ahora es más habitual usar la PIFT directa85,86 usando citometría de flujo. Las plaquetas del paciente se incuban con conjugados marcados con isotiocianato de fluoresceína

(FITC) específicos de isotipos (anti-IgG, anti-IgM y antiIgA) y la prueba se considera positiva cuando la intensidad de la fluorescencia es superior a la media + 2DE cuando se compara con los resultados obtenidos con suspensiones de mezclas de plaquetas de 10 o más donantes normales. En un estudio llevado a cabo con 75 pacientes con púrpura trombocitopénica idiopática usando microscopia en lugar de citometría de flujo, Von dem Borne y cols.87 encontraron una PIFT directa positiva débil (± a +) en el 60% de los pacientes y reacciones intensas (++ a ++++) en sólo el 26% de los pacientes. En el mismo estudio, la PIFT indirecta fue positiva con el suero del paciente en el 66% de los casos que tuvieron un PIFT directo positivo y fue positiva con una elución de éter de las plaquetas del paciente en el 94% de los mismos casos. Aunque estos resultados pueden reflejar una relativa insensibilidad del método, también pueden deberse a un anticuerpo de baja afinidad que es fácilmente eluido durante el procedimiento del análisis83 o en algunos casos indicar un mecanismo inmune alternativo de la trombocitopenia. La clase de Ig de los autoanticuerpos plaquetarios es similar en la trombocitopenia autoinmune idiopática y secundaria; mayoritariamente es IgG (92%), pero a menudo (también) es IgM (42%) y a veces (también) IgA (9%)87. Se detectan todas las subclases de IgG, pero las más frecuentes son IgG1 y/o IgG3. El modo más efectivo de detección de anticuerpos antigranulocitos es mediante una combinación de la prueba de inmunofluorescencia de granulocitos (GIFT)88 y la prueba de aglutinación de granulocitos (GAT)89. Sin embargo, los complejos inmunes y los agregados en el suero del paciente pueden todavía producir resultados falsos positivos. Esto puede ser un problema con el suero de pacientes adultos con neutropenia autoinmune secundaria, que deberían también ser evaluados para detectar la presencia de complejos inmunes (p. ej., Clq-enzyme-linked immunosorbent assay). La prueba de quimioluminiscencia de granulocitos (PQLG)90 es relativamente insensible a la presencia de complejos inmunes cuando se emplea suero inactivado, pero es incapaz de detectar anticuerpos IgM. Varias revisiones proporcionan una valoración de las técnicas disponibles para detectar anticuerpos y antígenos específicos de granulocitos91,92.

Anticuerpos inducidos por fármacos La investigación serológica de la trombocitopenia (neutropenia) inmune inducida por fármacos sigue el mismo patrón que la anemia hemolítica (v. pág. 218), con la excepción de que no siempre es posible obtener suficientes células para la prueba cuando existe trombocitopenia o neutropenia. Son necesarias las siguientes muestras de sangre: 1. Muestra de sangre de la fase aguda cuando el recuento celular está más disminuido. Si hay pocas células para comprobar a la vez la unión de anticuerpos y complemento a la célula, es necesario analizar el suero de la fase aguda contra las células del paciente durante la remisión. Estas pruebas demostrarán la base inmune de la citopenia.

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

Si el suero del paciente de la fase aguda se enfrenta a células de donantes normales, es esencial tener en cuenta las reacciones positivas debidas a aloanticuerpos HLA o específicos de célula en el suero del paciente. Además, resultados negativos con células de donantes normales pueden ser el resultado de ausencia del antígeno para al anticuerpo dependiente del fármaco particular (p. ej., debido a restricción genética del antígeno afectado)93. 2. Muestras posteriores tras interrumpir el fármaco. Idealmente, el muestreo debería hacerse cuando el fármaco se haya suspendido y el anticuerpo sea todavía detectable. Las pruebas empleando esta muestra, con o sin el fármaco en el sistema de análisis, son necesarias para demostrar el papel que desempeña el fármaco en la producción de la citopenia inmune. El fármaco puede añadirse directamente al sistema de análisis (e incluirse en la solución de lavado) o las células podrían ser pretratadas con el fármaco. Para algunos fármacos, el antígeno apropiado para la prueba es un metabolito y no el fármaco original; en estos casos puede usarse un antígeno del fármaco ex vivo de la orina o del plasma94.

Métodos de demostración de anticuerpos Los métodos básicos de inmunofluorescencia con antiglobulina y el análisis MAIPA se describirán en detalle. Sólo se hará una breve mención de otros métodos.

Método de inmunofluorescencia con antiglobulina

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Los métodos de inmunofluorescencia con antiglobulinas se basan en la técnica convencional de antiglobulinas (v. página 430) y son útiles para serología de plaquetas77, granulocitos88 y linfocitos95. PIFT y GIFTc se describen en detalle en este capítulo. Estas pruebas pueden leerse por examen directo de las células en suspensión, usando microscopio de fluorescencia, o por citometría de flujo. Estas pruebas pueden detectar aloanticuerpos, autoanticuerpos y anticuerpos inducidos por fármacos, y mediante el uso de reactivos antiglobulina monoespecíficos apropiados pueden determinar la clase de Ig y la subclase del anticuerpo y los componentes del complemento fijados a la célula. Ambas pruebas pueden usarse con células tratadas con cloroquina para diferenciar anticuerpos específicos de célula de los HLA96.

y/o anti-B pueden absorberse con las sustancias de eritrocitos A o B correspondientes. Los mejores resultados se obtienen con las preparaciones de células más recientes, pero se acepta algún retraso (v. más adelante). Los neutrófilos son más susceptibles que las plaquetas al daño por el paso del tiempo; las células deberían fijarse (v. más adelante) el día de la obtención, pero la serología puede retrasarse al día siguiente. Las plaquetas son más resistentes, y una muestra de sangre anticoagulada puede ser adecuada para la prueba hasta después de 2 días a temperatura ambiente (20 °C). Una vez fijadas, las plaquetas pueden mantenerse durante 3-4 días a –40 °C durante al menos 2 meses; sin embargo, tras descongelación de las plaquetas se produce algún daño en la membrana, que causa aumento de la fluorescencia original, lo que podría limitar la sensibilidad de la prueba97,98. Para tiempos más prolongados, debe usarse un crioprotector (p. ej., DMSO)98.

Suero del paciente El suero de la sangre venosa coagulada debería ser calentado a 56 °C durante 30 min para inactivar el complemento y conservado en volúmenes de 1-2 ml a –40 °C (para evitar descongelación repetida de los depósitos).

Suero control El suero de control negativo se prepara a partir de un grupo de 10 sueros de donantes normales masculinos del grupo AB que nunca hayan sido transfundidos. EL suero de control positivo con anticuerpos específicos plaquetarios (p. ej., antiHPA-1a), anticuerpos específicos de granulocitos o anticuerpos HLA multiespecíficos debería obtenerse de los centros de referencia.

Elución de las células sensibilizadas del paciente La elución es importante para confirmar la naturaleza de los anticuerpos de la inmunoglobulina fijada a la célula y para determinar la especificidad de los anticuerpos. Esto se aplica especialmente cuando no se demuestran anticuerpos en el suero del paciente, lo que a menudo ocurre en pacientes con trombocitopenia y neutropenia autoinmune. Se ha empleado la elución por descenso del pH del medio, con éter (o DMSO) y por calentamiento a 56 °C99. Para serología plaquetaria rutinaria, lo más conveniente es la elución con éter para los autoanticuerpos plaquetarios o el calentamiento a 56 °C para aloanticuerpos específicos de plaquetas.

Células del paciente y del panel de detección Las plaquetas y los granulocitos se preparan de sangre venosa obtenida en Na2-EDTA al 5% (p/v) en agua (9 volúmenes de sangre:1 volumen de anticoagulante). Para la serología plaquetaria el panel de células de detección debería obtenerse de donantes del grupo O con el fin de evitar reacciones positivas debidas a anti-A y antiB, pero esta medida no es necesaria para la serología de los granulocitos porque los antígenos A y B no se encuentran en los granulocitos. Si el suero de un paciente debe analizarse con plaquetas con incompatibilidad ABO, los anti-A c

Fison Ltd., Loughborough, Reino Unido.

Elución por calor Incubar las plaquetas o los granulocitos suspendidos en 0,5 ml de albúmina de suero bovino (ASB) al 0,2% en PBS durante 60 min a 56 °C. Centrifugar y retirar el sobrenadante que contiene el anticuerpo eluido.

Elución con éter Empleando tubos de cristal o plástico, mezclar plaquetas lavadas y concentradas obtenidas de 50 ml de sangre con EDTA con una parte de PBS/ASB (0,2%) y dos partes de éter, mediante agitación vigorosa durante 2 min. Incubar la mezcla durante 30 min a 37 °C en un baño con agitación

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

continua. Después de la centrifugación (2.800 g, 10 min), se forman 3 capas, formadas por éter, estroma y eluido. Pipetear el eluido con una pipeta Pasteur y evaluarlo en la PIFT indirecta con plaquetas de donante normal como se describe para el suero.

Preparación de las plaquetas 1. Preparar plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugación de sangre anticoagulada (200 g, 10 min). 2. Lavar las plaquetas tres veces (2.500 g, 5 min) en tampón PBS/EDTA (8,37 g de Na2-EDTA disuelto en 2,5 l de PBS, pH 7,2); resuspender las plaquetas minuciosamente cada vez. 3. Fijar las plaquetas en 3 ml de solución de paraformaldehído al 1% durante 5 min a temperatura ambiente. Una solución madre de PFA se prepara disolviendo 4 g de PFA (BDH) en 100 ml de PBS mediante calentamiento a 70 °C y mezclado esporádico. Añadir NaOH 1 mol/l gota a gota y mezclar continuamente hasta que la solución se aclare. Esta solución madre al 4% puede ser conservada a 4 °C protegida de la luz varios meses. Preparar una solución de trabajo de PFA al 1%, añadiendo 1 volumen de solución madre de PFA al 4% a 3 volúmenes de PBS y corregir el pH si es necesario hasta 7,2–7,4 con HCl 1 mol/l. Lavar las plaquetas dos veces como se ha descrito previamente y resuspender en tampón PBS/EDTA a una concentración de 250-500 × 109/l para usar en la PIFT.

Preparación de granulocitos 1. Mezclar sangre anticoagulada o sangre guardada de la preparación de plaquetas después de retirar PRP (y reconstituir a su volumen original con PBS) con 2 ml de solución Dextrano por 10 ml de sangre (Dextrano 150 inyección BP en 5% dextrosa). Incubar esta mezcla a 37 °C durante 30 min con un ángulo de unos 45° para acelerar la sedimentación de los eritrocitos, y entonces retirar el sobrenadante rico en leucocitos (SRL). 2. Los granulocitos pueden separarse por sedimentación de doble densidad (fig. 19.4). El SRL se deposita en 2 ml de medio de separación de linfocitos (MSL) (MSL = FicollHypaque ge: 1,077), que a continuación se deposita sobre 2 ml de un medio de resolución de mono y polis (MPRM) (MPRM = Ficoll-Hypaque ge: 1,114)d. El tubo con este gradiente de densidad se centrifuga a 2.500 g durante 5 min. Los granulocitos forman una capa opaca en la interfase MSL/MPRM de la que son recogidos con pipeteo cuidadoso (el examen microscópico muestra que las células de esta capa son predominantemente polimorfos neutrófilos). Los linfocitos pueden también ser recogidos de manera similar de la interfase plasma/MSL (p. ej., para usar en la prueba de inmunofluorescencia con linfocitos o LIFT)95. 3. Lavar los granulocitos tres veces a 400 g durante 5 min en tampón PBS/ASB (PBS pH 7,2 con ASB 0,2%). d

MSL y MPRM suministrados por Flow Laboratories Ltd.

Sobrenadante rico en leucocitos

Capa 1 Células mononucleares ± plaquetas Solución I Ficoll-Hypaque (ge 1,077) Capa 2 Granulocitos

Solución II Ficoll-Hypaque (ge 1,114)

Capa 3 Eritrocitos

Figura 19.4. Separación con doble densidad de linfocitos y granulocitos. El sobrenadante rico en leucocitos es separado en capas con Ficoll–Hypaque con una gravedad específica (ge) de 1,077 (Solución 1) y 1,114 (Solución 2) y después centrifugado a 2.500 g durante 5 min. Concentrado de linfocitos en capa 1; concentrado de granulocitos en capa 2.

4. Fijar los granulocitos en 3 ml de PFA al 1% durante 5 min a temperatura ambiente. 5. Lavar los granulocitos dos veces como antes y resuspender en tampón PBS/ASB a una concentración de alrededor de 10 × 109/l para usar en el GIFT.

Pruebas de inmunofluorescencia de plaquetas y granulocitos Los métodos serológicos para analizar plaquetas y granulocitos en las pruebas de inmunofluorescencia en suspensión son similares, excepto que las plaquetas son lavadas siempre en tampón PBS/EDTA y los granulocitos en tampón PBS/ASB. En la figura 19.5 se muestra un diagrama de flujo de la PIFT. Los reactivos antiglobulina marcados con FITC se usan como sigue: anti-Ig (poliespecífico), anti-IgG, anti-IgM y anti-C3. Deberían usarse fragmentos F(ab)2 de estos reactivos para minimizar la fluorescencia de membrana no específica debida a unión al receptor Fc, que constituye un problema especialmente con los granulocitos. La dilución óptima para cada reactivo debería ser determinada por titulación en damero. Centrifugar los conjugados FITC a 2.500 g durante 10 min antes de utilizarlos, para retirar la

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

Lavar x 3 en PBS/EDTA

Centrifugación

Lavar x 2 en PBS/EDTA

PRP PFA

RBC

Sangre con Na2-EDTA Separación de plaquetas

Fijación en paraformaldehído al 1%

37 °C 1 h

Lavar x 3 en PBS/EDTA

Prueba indirecta Prueba directa Suspensión de plaquetas 1 vol. de células en 1 vol. de suero en PBS/EDTA

Sensibilización

20 °C 1/2 h

Figura 19.5. Prueba de inmunofluorescencia plaquetaria. PBS, solución salina tamponada con fosfato; PFA, paraformaldehído; PRP, plasma rico en plaquetas; RBC, eritrocitos.

Lavar x 2 en PBS/EDTA

Añadir marcador fluorescente

fluorescencia residual y reducir la fluorescencia de fondo. En cada batería de pruebas deberían incluirse controles positivos y negativos (como se describe más arriba).

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Pruebas indirectas 1. Mezclar 0,1 ml de suero y 0,1 ml de suspensión celular, como se preparó previamente, en tubos de precipitado de plástico (7 × 50 mm). (El método puede también ser adaptado para emplearse con placas de microtitulación, las cuales tienen la ventaja de emplear volúmenes más pequeños.) 2. Incubar durante 30 min a 37 °C para pruebas de IgG y C3, y a temperatura ambiente para pruebas de IgM. Sólo para las pruebas de C3, sedimentar las células (1.000 g, 5 min), retirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 0,1 ml de suero humano descongelado recientemente como fuente de complemento. Incubar durante 30 min a 37 °C. 3. Lavar las células tres veces a 1.000 g, durante 5 min con el tampón apropiado (PBS/EDTA para plaquetas, PBS/ ASB para granulocitos); decantar el sobrenadante final. Este paso y los siguientes son comunes para las pruebas indirectas (es decir, el suero del paciente con las células del donante) y las pruebas directas (es decir, las células propias del paciente para detectar sensibilización in vivo).

2.a incubación

Examen con microscopio de fluorescencia

4. Añadir el reactivo antiglobulina fluorescente (0,1 ml de la dilución apropiada determinada por titulación en damero), mezclar el botón celular y dejar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. 5. Lavar dos veces como antes y retirar el sobrenadante. 6. Mezclar 0,5 ml de glicerol-PBS (3 volúmenes de glicerol:1 volumen de PBS) con el botón celular y colocar sobre un portaobjetos con un cubre. 7. Examinar al microscopio usando un objetivo ×40 e iluminación ultravioleta epifluorescente.

Puntuación de los resultados Las reacciones en la PIFT y la GIFT pueden ser puntuadas en un escala desde negativas (–) hasta distintos grados de positividad desde + a + + + +. Aunque es subjetivo, este método de puntuación en manos experimentadas puede conseguir resultados semicuantitativos en la PIFT100. En general, las plaquetas y granulocitos normales incubados con suero AB no se hacen fluorescentes después de incubación con un reactivo antiglobulina FITC apropiadamente diluido. A veces, el control negativo puede mostrar picos débiles de fluorescencia (hasta dos puntos de fluorescencia en algunas células); en estos casos el resultado de la prueba sólo es calificado como positivo si es claramente más intenso que el control negativo (suero AB). La fluores-

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

cencia más intensa en el control negativo debería suscitar dudas sobre la calidad de la prueba.

Cuando se leen las pruebas con el microscopio de fluorescencia, es importante reconocer y tener en cuenta cualquier fluorescencia debida al daño celular inducido por cloroquina, que es más probable con los granulocitos que con las plaquetas. Las células dañadas se reconocen fácilmente por su brillante fluorescencia homogénea. Estas células deberían ser excluidas de la evaluación, y sólo deberían considerarse positivas las células que muestren obvia fluorescencia punteada. Las células tratadas con cloroquina inicialmente se valoraban con el método de fluorescencia de antiglobulinas fluorescentes, pero también pueden usarse en métodos enzimáticos y con antígenos marcados con isótopos.

Uso de la citometría de flujo Con la simplificación de la citometría de flujo y mejoría de los programas informáticos, esta técnica se usa cada vez más como primera forma de análisis de la PIFT por los laboratorios de referencia de plaquetas, porque su sensibilidad ha mejorado. Sin embargo, es más difícil trabajar con citometría de flujo con plaquetas que con otras células, y debe prestarse particular atención para prevenir la agregación y asegurar suspensiones de células individualizadas. La presencia de partículas plaquetarias y detritus puede también causar confusión. Las consideraciones técnicas en la aplicación de la citometría de flujo al estudio plaquetario ha sido objeto de varias revisiones85,86.

Interpretación de los resultados de las células tratadas con cloroquina

Tratamiento con cloroquina de plaquetas y granulocitos

Los resultados típicos con anticuerpos HLA y anticuerpos específicos de célula se muestran en la tabla 19.19. Si un suero que ha demostrado contener anticuerpos anti-HLA mediante LCT y/o LIFT da reacciones iguales o más fuertes con las células tratadas con cloroquina que con las células no tratadas, ello indica que un anticuerpo específico de célula está también presente. El Second Canadian Workshop on Platelet Serology97 concluyó que una reacción más débil con plaquetas tratadas con cloroquina debería ser interpretada con cautela; esto podría indicar reactividad HLA residual, especialmente ante la presencia de títulos elevados de anticuerpos HLA multiespecíficos. Pero, si todavía se sospecha la presencia de un anticuerpo plaquetario específico, deberían emplearse otros métodos para confirmarlo (p. ej., MAIPA empleando apropiados anticuerpos monoclonales para captarlo; v. más adelante). Deberían adoptarse precauciones similares en la interpretación de los resultados del GIFT con las células tratadas con cloroquina.

Para el tratamiento con cloroquina, las plaquetas deberían ser preparadas a partir de sangre fresca o sangre conservada durante una noche a 4 °C; los granulocitos son útiles sólo si se preparan inmediatamente79,101. Una consideración importante es la extensión del daño de la membrana celular inducido por la cloroquina, que es mínima con células recientes. 1. Las células se preparan como ya se describió. Dos tercios de las células son tratados con cloroquina; el tercio restante no se trata. Después del lavado, y antes de la fijación con PFA, el botón celular es incubado con 4–5 ml de difosfato de cloroquina en PBS (200 mg/ml, pH ajustado a 5,0 con NaOH 1 mol/l) durante 2 h a temperatura ambiente con mezclado ocasional, o tras una noche a 4 °C sin mezclar, si esta estrategia resulta más adecuada para el laboratorio. 2. Lavar tres veces en el tampón apropiado y fijar en PFA al 1% como se describió previamente. El agrupamiento de las células durante el lavado puede ser un problema después del tratamiento con cloroquina, especialmente con granulocitos; los agregados celulares deberían dispersarse por aspiración cuidadosa repetida con pipeta Pasteur. La suspensión celular final para las pruebas serológicas debería prepararse como se describió previamente.

Análisis MAIPA El principio del análisis MAIPA se muestra en la figura 19.6. La prueba está basada en el uso de anticuerpos monoclonales, tales como anti-IIb/IIIa, anti-Ib/IX, anti-Ia/IIa y antiHLA de clase I, para «captar» glucoproteínas específicas de la membrana plaquetaria. La disponibilidad de anticuerpos monoclonales apropiados ha conducido a una aplicación clíni-

Tabla 19.19. Reacciones de los anticuerpos antiplaquetas y antigranulocitos empleando células con y sin tratamiento con cloroquina Sueros

Células no tratadas

Células tratadas con cloroquina

Plaquetas

Granulocitos

Plaquetas

Granulocitos

Negativa

–

–

–

–

Anticuerpos HLA multiespecíficos

+++

++

–

–

Anticuerpos específicos de granulocitos

–

++

–

+++

Anticuerpos específicos de plaquetas

+++

–

+++

–

HLA, antígeno leucocitario humano.

19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

IgG de cabra antihumana marcada con enzima *

Anticuerpo antiplaqueta humana

Plaqueta

gp

Lisis

AcMo de ratón contra glucoproteína plaquetaria

gp

IgG de cabra antirratón Microplaca

Figura 19.6. Inmovilización con anticuerpos monoclonales de los antígenos plaquetarios (MAIPA): principio del método. AcMo, anticuerpo monoclonal; gp, glucoproteína de membrana plaquetaria.

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ca más amplia de este método78. El mismo principio puede usarse con los granulocitos, dependiendo de la disponibilidad de anticuerpos monoclonales apropiados78,102. El siguiente protocolo de análisis se desarrolló del método original descrito por Kiefel78,103. 1. Preparar plaquetas como para la PIFT (v. pág. 439), omitiendo la fijación con paraformaldehído. 2. Resuspender un botón de 50-100 × 106 plaquetas en 30 μl del suero humano o plasma que debe analizarse e incubar a 37 °C durante 30 min en una microplaca con pocillos en U. 3. Lavar las plaquetas dos veces en tampón PBS/EDTA (8,37 g de Na2-EDTA en 2,5 l de tampón fosfato solución salina [v. pág. 589]). Resuspender las plaquetas en 30 μl de anticuerpos monoclonales de ratón (anti-Gp IIb/IIIa, Ia/IIa, Ib/IX o HLA a 20 μg/ml) e incubar a 37 °C durante 30 min. 4. Lavar dos veces las plaquetas en tampón PBS/EDTA, lisar por la adición de 100 μl de solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenga Nonidet P-40 al 0,5% y dejar a 4 °C durante 30 min. 5. Transferir las plaquetas lisadas a un tubo cónico de 2 ml y centrifugar a 11.600 g durante 30 min a 4 °C para retirar las partículas. 6 Diluir 60 μl del sobrenadante resultante con 180 μl de tampón de lavado TBS (Nonidet P-40 al 0,5%, Tween 20 al 0,05% y CaCl2 0,5 mmol). Transferir 100 μl de plaquetas lisadas diluidas, por duplicado, a una microplaca con pocillos planos previamente cubiertos con IgG de cabra antirratóne. Dejar a 4 °C durante 90 min.

e La microplaca se prepara por la adición a cada pocillo de 100 μl de IgG de cabra antirratón (Sera-Lab, código SBA 1030-01) a 3 μg/ml en una capa de tampón carbonato, pH 9,6. Dejar la placa reposar por la noche a 4 °C. A la mañana siguiente, lavar la placa cuatro veces con tampón de lavado TBS. Dejar el último lavado sobrenadando durante 30 min para «bloquear» la adsorción de proteínas no específicas al plástico y seguidamente decantar.

7. Lavar los pocillos de la microplaca cuatro veces con 200 μl de tampón de lavado TBS y seguidamente añadir 100 μl de IgG antihumana marcada con fosfatasa alcalina (Jackson, código 109-055-008) diluido a 1:4.000 en tampón de lavado TBS. Mantener a 4 °C durante otros 90 min y a continuación lavar los pocillos cuatro veces con tampón de lavado TBS y añadir 100 μl de solución de sustrato a cada pocillo (p-nitrofenil fosfato a 1 mg/ml en tampón dietanolamina, pH 9,8). 8. Medir el cambio de color resultante a los 30 min usando un espectrofotómetro de longitud de onda dual (p. ej., Bio-Rad modelo 450). Expresar los resultados como la media de absorbancia a 405 nm de las pruebas duplicadas, menos la media de ocho blancos que contengan tampón de lavado TBS en lugar de lisado plaquetario. Usar suero AB de un grupo de muestras como control negativo.

Otros métodos Se han desarrollado varios métodos distintos a los previamente descritos para detectar anticuerpos plaquetarios. Las técnicas de adherencia de eritrocitos en fase sólida (SPRCA), algunas de las cuales se encuentran disponibles comercialmente, evolucionaron como alternativa a la lectura microscópica inicialmente requerida para la PIFT. Estos análisis combinan la tecnología tradicional de la serología de los eritrocitos con la serología plaquetaria. Las plaquetas son capturadas en pocillos de microtitulación; se aplican los anticuerpos; y después de lavado y adición de globulina antihumana, se detectan los aloanticuerpos ligados contra antígenos de las plaquetas o contra antígenos HLA usando eritrocitos de cordero tratados con ácido tánico104 o eritrocitos RhD positivos sensibilizados con anti-D105. Las SPRCA son pruebas rigurosas y sensibles que se prestan a la automatización y el tratamiento de las plaquetas con cloroquina puede emplearse eficazmente para filtrar los anticuerpos HLA. El GTI PakPlus es un conjunto de anticuerpos plaquetarios basado en el principio del ELISAf. Los micropocillos cubiertos con glucoproteínas plaquetarias o antígenos HLA clase I se incuban con el suero problema. Tras la incubación, seguida de lavado para eliminar las proteínas no fijadas, cualquier anticuerpo fijado al micropocillo es detectado usando reactivos de globulina antihumana conjugada con fosfatasa alcalina (anti-GAM o anti-IgG) y el sustrato apropiado. Los resultados se consideran positivos cuando el cociente entre la proporción de la absorbancia media de la muestra problema y la del suero control normal sea igual o superior a 2,0106. Con respecto a las pruebas de anticuerpos antigranulocitos, cuando se trabaja con el GIFT o GAT, la identificación de los aloanticuerpos requiere paneles de granulocitos tipados, que no pueden preservarse más que unas pocas horas.

f

Quest Biomedical, Solihull B90 2EL, Reino Unido.

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444

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Se ha descrito una técnica que usa extractos de antígenos de granulocitos que recubren pocillos en U de placas de Terasaki y una prueba de hemaglutinación pasiva microsurtida. El suero del paciente y los controles apropiados (sueros que contengan anticuerpos específicos de los granulocitos, anticuerpos monoclonales, tales como anti-CD16 y anti-NA1 y suero de donantes normales) se añaden a los pocillos y, tras incubación y lavado, se añaden indicadores de eritrocitos (eritrocitos de cordero recubiertos con IgG antihumana y antirratón). Si se consolida a gran escala, esta técnica, junto con la caracterización molecular de los antígenos, podría hacer que la inmunología de los granulocitos estuviese más fácilmente disponible en los laboratorios de referencia107.

Determinación del genotipo molecular de los aloantígenos plaquetarios La aplicación de la tecnología del ADN a la determinación del genotipo de las plaquetas se basa en el conocimiento de que los sistemas antigénicos plaquetarios son el resultado de un cambio único de bases en el ADN, lo que conduce a un polimorfismo de un único aminoácido en las glucoproteínas de la membrana plaquetaria (v. tabla 19.13). La determinación del genotipo molecular comporta la amplificación de los segmentos relevantes del ADN genómico de cualquier célula nucleada mediante PCR en combinación con cebadores con secuencias específicas108 o por análisis con enzimas de restricción específicas de los alelos109 o hibridación dot blot de alelos específicos de oligonucleótidos110. De la variedad de las técnicas disponibles basadas en la PCR, la PCR con cebadores específicos de secuencia (PCRSSP) es la más ampliamente usada en el Reino Unido111 para la determinación de HPA 1 a 5. Actualmente, se acepta que la determinación molecular del genotipo es una parte esencial de la confirmación de la especificidad asignada a los aloanticuerpos plaquetarios, además de permitir la investigación de pacientes con trombocitopenia grave haciendo posible la determinación del genotipo de las plaquetas fetales al inicio del embarazo para evaluar el riesgo de trombocitopenia aloinmune.

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

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19 Antígenos y anticuerpos de las células sanguíneas: eritrocitos, plaquetas y granulocitos

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20 Aspectos de laboratorio de las transfusiones sanguíneas Megan Rowley y Clare Milkins Progresos recientes en las transfusiones sanguíneas Sistemas de compatibilidad pretransfusionales Identificación y almacenaje de muestras de sangre Documentación del proceso de transfusión Determinación de los grupos ABO y D Determinación del grupo ABO Determinación del grupo D Detección de anticuerpos Panel de hematíes Técnicas de antiglobulina indirecta Identificación de anticuerpos Determinación del fenotipo Paneles y técnicas adicionales Selección y transfusión de eritrocitos Pruebas cruzadas Elección de la técnica Transfusiones urgentes Determinación rápida del grupo ABO y D Transfusión masiva

as transfusiones sanguíneas seguras y efectivas requieren la combinación de los esfuerzos de los centros de transfusiones sanguíneas, de científicos y de clínicos, para asegurar la aplicación de la mejor calidad a todos los sistemas de un complejo proceso de «vena a vena». Este capítulo proporciona una descripción de la estructura de laboratorio que se requiere para proporcionar los productos sanguíneos adecuados, al paciente adecuado y en el momento adecuado. La creciente concienciación de que puede haber problemas proviene de varias fuentes incluyendo el plan de hemovigilancia de riesgos graves de las transfusiones del Reino Unido, que se inició en 19961,2. Este plan de informes confidenciales, que se sirve de un detallado análisis de errores, ha proporcionado datos que han permitido a los organismos nacionales y centros de transfusión locales introducir medidas para reducir el riesgo. Está claro que pueden ocurrir múltiples errores y que muchos de ellos no pueden ser controlados por el centro de transfusión (figs. 20.1 y 20.2). En el seno del centro debería llevarse a cabo la aplicación de protocolos estrictos para el etiquetado y análisis, empleo de procedimientos de labora-

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Serología prenatal y enfermedad hemolítica del recién nacido Enfermedad hemolítica del recién nacido Serología prenatal Predicción del grupo sanguíneo fetal Valoración prenatal de la gravedad de la enfermedad hemolítica del recién nacido Enfermedad hemolítica ABO del recién nacido Pruebas de compatibilidad en situaciones transfusionales especiales Neonatos y niños en los primeros 4 meses de vida Transfusiones intrauterinas (fetales) Pacientes que reciben transfusiones a intervalos cortos Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas Estudio de una reacción transfusional Reacciones transfusionales agudas Reacciones transfusionales hemolíticas retardadas

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torio rigurosos y documentación fiable, y frecuente formación del personal. Este capítulo versa sobre el estudio de las muestras de los pacientes previo a la administración de los productos san-

Múltiples errores contribuyen a muchas transfusiones de «sangre erróneas» 5 errores

2

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7

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Figura 20.1. Datos del SHOT (Serious Hazards of Transfusion) 20031,2 que muestran que en 348 casos analizados en los que se transfundió sangre errónea, ocurrieron múltiples errores en el 52% de los casos.

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Distribución de los errores totales de acuerdo con las principales categorías informadas

27%

2%

31% 40%

Prescripción, muestreo y peticiones Banco de sangre Recogida y administración Departamento de transfusiones sanguíneas del hospital

Figura 20.2. Datos del SHOT (Serious Hazards of Transfusion) 20031,2 que muestran la distribución de errores de acuerdo con las principales categorías informadas, de un total de 588 errores del análisis de 348 informes completos.

guíneos compatibles, incluyendo la identificación de los anticuerpos de los eritrocitos. También incluye las pruebas de compatibilidad y el estudio de las reacciones transfusionales y las pruebas que se requieren en otras situaciones especiales incluyendo las transfusiones prenatales y posnatales. Los organismos profesionales nacionales, como el British Committee for Standards in Haematology (BCSH)3 y el AABB4 (inicialmente la American Association of Blood Banks), emiten guías para los centros de transfusión y se hará referencia a las mismas cuando sea apropiado. La Directiva Europea de la Sangre (Directiva 2002/98/EC) se convierte en ley en los países miembros en 2005; esto tiene importantes implicaciones para la práctica de transfusiones en los hospitales, particularmente en los términos de seguimiento de «vena a vena» de los productos sanguíneos, la necesidad de registros de almacenaje de las transfusiones durante 30 años y el requisito de un sistema de control de calidad5. El gobierno del Reino Unido continúa promoviendo la transfusión segura y eficaz de los productos sanguíneos a través de sus dos Health Service Circulars6,7. Estos documentos tienen por objetivo que se dé un enfoque colectivo a la seguridad de las transfusiones sanguíneas por medio de acuerdos con las autoridades clínicas y que se promueva la buena práctica transfusional a través de los comités y equipos de transfusión hospitalarios.

PROGRESOS RECIENTES EN LAS TRANSFUSIONES SANGUÍNEAS Desde la edición previa de este libro, se han producido importantes cambios en los centros de transfusiones sanguíneas. Ahora son habituales las etiquetas con códigos de barra en productos sanguíneos, reactivos, muestras de pa-

cientes y equipos de laboratorio, lo que resulta en una transferencia más segura de la información, libre de los errores de trascripción que se asocian con los métodos manuales. Las técnicas de aglutinación en columna y en fase sólida (v. cap. 19) pueden emplearse tanto en maquinas automáticas como en técnicas manuales, y en el 80% de los laboratorios de los hospitales del Reino Unido estas tecnologías han reemplazado parcial o totalmente a las técnicas en tubo y microplacas en fase líquida para la detección de anticuerpos8. Aunque poseen muchas ventajas, también existen algunas restricciones impuestas por el hecho de que la mayoría de las tarjetas/casetes de uso común en aglutinación en columna tienen seis columnas. Cada laboratorio individual necesita tomar decisiones sobre la selección de los perfiles y reactivos cuando emplean esta tecnología para la determinación del grupo sanguíneo, y es vital que cualquier prueba abreviada en un sistema automático o semiautomático sea cuidadosamente evaluada por el riesgo que podría resultar si se omitieran controles importantes9. Los sistemas informatizados almacenan detalles de los pacientes y resultados de las pruebas de laboratorio, lo que permite acceder a importante información de manera oportuna y precisa. Muchos interactúan con analizadores automáticos del grupo sanguíneo y algunos usan programas para interpretar los resultados de las pruebas. Los algoritmos informáticos apoyan la «emisión electrónica» de sangre a pacientes con una detección negativa de anticuerpos sin la necesidad de usar una prueba de compatibilidad con antiglobulinas, y en el Reino Unido el 19% de los laboratorios están usando este sistema para algunos o todos sus pacientes8. La aplicación y el uso de la automatización para todos los aspectos de las pruebas de compatibilidad continúan aumentando. La automatización incluye en un proceso con un soporte único varios o todos los procesos distintos de las pruebas de compatibilidad. Ello proporciona un aumento marcado en el nivel de seguridad respecto a las pruebas manuales y podría proporcionar justificación para las pruebas abreviadas pretransfusionales (p. ej., el abandono de la detección duplicada del grupo D [previamente llamado «RhD»] o la determinación indirecta del grupo ABO). Antes de cualquier acortamiento de un proceso establecido debe hacerse y documentarse una valoración del riesgo, considerando la presencia o ausencia de funciones clave en el equipo automático. La guía del BCSH para los procedimientos de compatibilidad9 proporciona una lista de factores que deben tenerse en cuenta; aconsejamos a los lectores su consulta antes de implementar los sistemas automáticos o semiautomáticos.

SISTEMAS DE COMPATIBILIDAD PRETRANSFUSIONALES El proceso de suministrar sangre para una transfusión conlleva muchos pasos, que tienen que ser completados de forma fiable. Incluyen los siguientes:

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20 Aspectos de laboratorio de las transfusiones sanguíneas

1. Las muestras de sangre tienen que ser obtenidas del paciente correcto y etiquetadas a la cabecera de su cama en un procedimiento único e ininterrumpido. La muestra debe ser identificada como mínimo con un nombre y un apellido correctamente deletreados, la fecha exacta de nacimiento y un número de paciente único y preciso. La muestra debería ser fechada y firmada por la persona que la obtiene9. Algunas guías recomiendan no aceptar etiquetas impresas automáticamente en las muestras de sangre para las pruebas de compatibilidad. El centro debería tener una política de rechazo de las muestras etiquetadas incorrectamente10, aunque un reciente estudio en hospitales de Inglaterra y Norte de Gales mostró una considerable variación en el contenido y aplicación de estas políticas11. La solicitud de servicios debería incluir los identificadores del paciente previamente expuesto, así como información clara sobre el origen de la petición y la localización del paciente y detalles clínicos incluyendo una detallada justificación para la petición. También son necesarias la historia transfusional previa y cualquier consideración especial para la selección de la sangre (p. ej., prueba de citomegalovirus [CMV] o irradiación). 2. Debe realizarse una determinación precisa de los grupos ABO y D de la muestra del paciente. 3. La detección de anticuerpos en el plasma/suero del paciente (o en el plasma/suero de la madre en el caso de un neonato) debería permitir detectar cualquier anticuerpo antieritrocitario clínicamente significativo. En el caso de una detección positiva de anticuerpos antieritrocitarios, debería procederse a su identificación para facilitar la selección de sangre compatible. 4. Debería verificarse la existencia de registros transfusionales para comparar los resultados actuales e históricos. 5. Deberían seleccionarse los componentes apropiados de la sangre y considerarlos como útiles para la transfusión para un paciente concreto empleando pruebas cruzadas serológicas o validación electrónica. 6. Debería existir documentación de fácil acceso para asegurar que los resultados de los procedimientos de compatibidad de laboratorio están disponibles a la cabecera del paciente para permitir su revisión antes de transfundir el producto sanguíneo. Ello podría incluir una etiqueta de compatibilidad en la bolsa de sangre (fig. 20.3) y un formulario de compatibilidad. Los pacientes deben ser identificados con una pulsera y los productos sanguíneos deben ser prescritos en una hoja de tratamiento o de administración de fluidos10. En algunos países se realiza una revisión adicional del grupo sanguíneo del paciente, a la cabecera de la cama, previa al inicio de la transfusión.

Identificación y almacenaje de muestras de sangre Para las pruebas de las transfusiones sanguíneas, dependiendo de la práctica habitual del centro, podría requerirse una muestra coagulada o sangre anticoagulada con EDTA. Las muestras coaguladas deben introducirse en un

Figura 20.3. Unidad de concentrado de eritrocitos con una etiqueta de compatibilidad.

tubo seco, pero no en un tubo con gel separador (v. cap. 19, pág. 426). Cuando se reciben en el laboratorio, deben revisarse los detalles del formulario de solicitud frente a la muestra de sangre. Cada muestra de sangre debe ser etiquetada con un único número de muestra. Los códigos de barras ofrecen las ventajas de una concluyente identificación de la muestra y reducción de los errores de transcripción. Las muestras etiquetadas inadecuada o erróneamente no deberían emplearse para las pruebas pretransfusionales9. Debe tenerse gran cuidado en la selección e identificación de la muestra previamente a cualquier prueba. La transposición de las muestras en el laboratorio puede conducir a la asignación a un paciente de un grupo sanguíneo incorrecto, con serias consecuencias, incluyendo transfusiones con incompatibilidad ABO. Si es posible, debe emplearse para las pruebas muestra del tubo primario. Si las muestras se separan, el plasma/suero debe ser identificado de manera clara y precisa y se deben tomar precauciones especiales (fig. 20.4). Si se prevé la realización de pruebas repetidas con la muestra, el almacenaje en pequeñas alícuotas reduce el riesgo de deterioro producido por repetidas descongelaciones/congelaciones de muestras de mayor volumen. Las muestras de sangre completa deberían analizarse lo antes posible porque se deterioran con el tiempo. Los pro-

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Cuando se use suero para la determinación del grupo sanguíneo y las pruebas de incompatibilidad, cualquier eritrocito en el sistema de la prueba debería ser lavado y suspendido en solución salina que contenga EDTA. La presencia de complemento en el suero puede causar lisis y por lo tanto podría conducir a mala interpretación de las pruebas basadas en aglutinación. Además, reacciones falsas negativas pueden ocurrir en las pruebas cruzadas de centrifugación inmediata con anticuerpos ABO potentes, cuando la fijación rápida del complemento causa un efecto prozona (la unión de C1 inhibe la aglutinación). La solución salina con EDTA no es necesaria cuando se usa plasma.

Figura 20.4. Precauciones que deben tomarse cuando se usa suero en lugar de plasma para la determinación del grupo sanguíneo y las pruebas de compatibilidad.

blemas asociados con el almacenaje incluyen la rotura de los eritrocitos, la pérdida del complemento del suero y el descenso de la potencia de los anticuerpos. La guía del BCSH9 indica los límites de empleo y se resumen en la tabla 20.1. Si se almacenan muestras separadas de plasma o suero para pruebas cruzadas serológicas posteriores, se debe tener cuidado en asegurar que el paciente no ha sido transfundido en ese intervalo. Se recomienda almacenar las muestras durante 7 días en todos los pacientes que han sido transfundidos para permitir investigar cualquier reacción transfusional subsiguiente12,13.

Documentación del proceso de transfusión Todas las etapas del proceso de transfusión deben estar claramente documentadas y las normas actuales de la Unión Europea requieren que los registros deben ser consultables durante 30 años5. Esto permite que cualquier producto sanguíneo pueda ser rastreado desde el donante hasta el receptor para aportar información sobre cualquier riesgo infectivo potencial para el receptor. Este sistema se ha evaluado en el estudio retrospectivo de la hepatitis C emprendido por el National Blood Service del Reino Unido14. Los registros informáticos son más fáciles de buscar que los registros en papel, pero es probable que los sistemas informáticos queden obsoletos y tengan que ser reemplazados varias veces durante el período obligatorio de 30 años, por lo que se deben tomar precauciones para almacenar los datos históricos en un formato accesible cuando se realice una sustitución del sistema informático15. Los registros mantenidos por el paciente son útiles para pacientes tratados en más de una institución, particularmente si tienen anticuerpos antieritrocitarios y requieren sangre con determinación del fenotipo o si tienen requerimientos especiales por su enfermedad subyacente o su tratamiento. Algunos centros

Tabla 20.1.

transfusionales proporcionan registros del tamaño de una tarjeta de crédito a pacientes con anticuerpos antieritrocitarios, y existen tarjetas similares para pacientes que requieren productos sanguíneos con irradiación celular16. En Hong Kong, se ha propuesto un sistema para codificar el fenotipo de los eritrocitos de todos los ciudadanos, de manera que forme parte de la información disponible en la tarjeta de identificación17.

DETERMINACIÓN DE LOS GRUPOS ABO Y D La determinación de los grupos ABO y D debe realizarse mediante una técnica validada con controles apropiados. Antes del uso de nuevos lotes de reactivos para determinar el grupo debe comprobarse su fiabilidad con las técnicas empleadas en el laboratorio. Estos reactivos deben almacenarse según las instrucciones del fabricante.

Determinación del grupo ABO La determinación del grupo ABO es la prueba serológica única más importante realizada en las pruebas de compatibilidad; consecuentemente, es imperativo que la sensibilidad y seguridad del sistema de la prueba sean máximas. El hecho de que los anticuerpos anti-A y anti-B aparezcan de manera natural permite enfrentar el suero/plasma del paciente a células identificadas como A y B en la llamada «prueba sérica». Esto es una excelente comprobación intrínseca para el grupo «hemático» o celular y se ha considerado siempre una parte integral de la determinación del grupo ABO, permitiendo la división de la lectura y registro de los resultados de la prueba en dos procedimientos diferenciados. Sin embargo, la llegada de sistemas seguros completamente automáticos, unidos a seguros sistemas tecnológicos de información, que combinados permiten evitar errores en el procedimiento de la determinación del grupo ABO, ha hecho que algunos laboratorios actualmente omitan la prueba sérica de estudio del grupo sanguíneo cuando analizan muestras para las que se disponga de una determinación histórica del grupo. Esto sólo debería considerarse tras una cuidadosa valoración del riesgo y teniendo en cuenta que la primera muestra obtenida podría haber sido de un paciente erróneo9,11, lo que puede suceder en alrededor de 1:2.000 muestras18. Debería investigarse cualquier discrepancia entre las pruebas hemática y sérica de la determinación del grupo, y cualquier prueba que se repita debe realizarse a partir de células obtenidas de la muestra original más que de una suspensión ya preparada de células.

Límites recomendados para la conservación de muestras para pruebas de compatibilidad9

Muestra

18–25 °C

4 °C

–20 °C

Sangre completa anticoagulada con EDTA

Hasta 48 h

Hasta 7 días

No aplicable

Plasma/suero separado

No aplicable

Hasta 7 días

6 meses

20 Aspectos de laboratorio de las transfusiones sanguíneas

Reactivos para la determinación del grupo ABO Previamente a la introducción de reactivos monoclonales, tradicionalmente, para las pruebas de determinación del grupo de los eritrocitos se empleaban anticuerpos policlonales anti-A, anti-B y anti-AB. Los reactivos anti-AB (procedentes de suero del grupo O) sirven como comprobación adicional de las células aglutinadas por anti-A y/o anti-B, pero también son capaces de detectar antígenos A de expresión débil (p. ej., Ax). Los reactivos policlonales han sido reemplazados por mejores reactivos monoclonales anti-A y anti-B, y aunque existen reactivos monoclonales anti-AB y anti-A+B, no existe necesidad de incluirlos en las pruebas rutinarias de determinación del grupo sanguíneo. Las células A1 y B se emplean para la determinación sérica del grupo; pueden incluirse células del grupo O o un autocontrol para asegurar que las reacciones con anti-A y anti-B no se deben a la presencia de anticuerpos fríos.

Determinación del grupo D La determinación del grupo D se realiza generalmente, al mismo tiempo que la del grupo ABO, por comodidad y para minimizar los errores de trabajo, que podrían aumentar por la manipulación repetida de las muestras del paciente. En ausencia de una automatización segura, las pruebas deberían realizarse por duplicado porque no existe un homólogo de la prueba inversa de determinación del grupo ABO.

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Reactivos para la determinación del grupo D Los reactivos monoclonales no tienen el problema de una posible contaminación con anticuerpos de especificidad no deseada, como ocurría con los agentes policlonales. Por ello, la prueba por duplicado puede realizarse usando el mismo reactivo anti-D, aunque debería ser dispensado como si fueran dos reactivos distintos. El DVI es el D parcial con el menor número de epítopos; por ello los individuos DVI son los que tienen mayor probabilidad de formar anti-D9,19. Por esta razón20, deberían seleccionarse para evaluar muestras de pacientes reactivos monoclonales anti-D que no detecten DVI. El empleo de reactivos antiCDE ha conducido a mala interpretación de las células r′ y r′′ en los ejercicios del National External Quality Assessment Scheme (NEQAS) del Reino Unido, y dado que no tiene valor en la determinación rutinaria del grupo del paciente, su uso no se recomienda9. La selección de reactivos monoclonales anti-D de elevada afinidad permitiría la detección de todos, salvo los tipos más débiles, del D débil, anulando la necesidad de usar técnicas más sensibles para revisar el estatus D de evidentes D negativos. Algunos reactivos anti-D tienen elevados niveles de potenciador (p. ej., polietilenglicol) y deberían usarse con precaución; es esencial un diluyente control, para demostrar que dicho diluyente no promueve la aglutinación de los eritrocitos analizados, como podría ocurrir si las células del paciente estuvieran cubiertas in vivo con inmunoglobulina G (IgG); cualquier positivo observado en el control, aunque sea débil, invalida el resultado de la prueba. Los reactivos anti-D se proporcionan en múltiples equipos diferentes, y

los responsables de la selección y compra deberían conocer el contenido, especificidad y potenciación del reactivo escogido.

Métodos Hay varias técnicas disponibles para la determinación del grupo ABO y D incluyendo tubos, portas, microplacas y columnas. Se han descrito otras técnicas para la determinación del grupo sanguíneo (p. ej., citometría de flujo)21, pero no se emplean rutinariamente. Se debe tener cuidado en emplear el reactivo apropiado, dado que no todos han sido validados por los fabricantes para todas las técnicas.

Pruebas en tubos y portas Las pruebas en tubo con centrifugación se usan con frecuencia, especialmente para pruebas urgentes, cuando se efectúa cada vez un pequeño número de pruebas. Las técnicas en portaobjetos o placas son ampliamente usadas para la determinación de los grupos ABO y D en países de escasos recursos. Las pruebas en tubo con centrifugación deberían realizarse en tubos de plástico de 75 × 10 o 75 × 12 mm. La prueba de centrifugación inmediata puede hacerse en casos de emergencia, mientras que en las pruebas rutinarias los tubos se dejan durante 15 min a temperatura ambiente (unos 20 °C) antes de la centrifugación durante 1 min a 150 g. Se utilizan volúmenes iguales (1 o 2 gotas del cuentagotas del reactivo comercial o de una pipeta Pasteur) de reactivo líquido o suero/plasma y suspensiones de células al 2%. Los eritrocitos del paciente (diluidos en un tampón fosfato salino [PBS]) deberían ser enfrentados a reactivos de eritrocitos A1 y B (determinación del grupo inversa). Además, el suero o plasma debería enfrentarse a las propias células del paciente o células del grupo O (es decir, un control negativo), para excluir reacciones con células A y B como resultado de aglutininas frías, distintas a las anti-A o anti-B de la muestra del paciente. Para prevenir la mala interpretación de los resultados obtenidos por la presencia de hemólisis cuando se emplea suero, se recomienda que el diluyente para la resuspensión de las células en la determinación inversa del grupo contenga EDTA (v. más adelante). Se mezcla la suspensión por agitación de los tubos y se mantiene en reposo durante 15 min. La aglutinación debería leerse como se describe en la página 428. Debería evaluarse cualquier discrepancia entre los resultados de la determinación directa del grupo de los eritrocitos y la determinación por la prueba sérica, y para la repetición de cualquier prueba deberían emplearse células obtenidas de la muestra original en vez de las de la suspensión de hematíes ya preparada. La determinación por la prueba sérica no se realiza en niños menores de 4 meses de edad porque aún no se han generado los anticuerpos correspondientes.

EDTA como diluyente Solución madre. Preparar una solución de EDTA (sal dipotásica) en agua destilada a 0,1 mol/l. Ajustar el pH a 7,0 empleando NaOH a 5 mmol/l. Solución de trabajo. Mezclar 1 volumen de la solución madre con 9 volúmenes de solución salina o solución sali-

453

454

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

na de baja fuerza iónica (LISS). Comprobar el pH y ajustar a 7,0 si es necesario.

9. Los resultados pueden leerse visualmente o con un lector automático de placas.

Método en portaobjeto

Técnicas de aglutinación en columna (fig. 20.5)

En situaciones de emergencia, se puede realizar una determinación rápida del grupo ABO en portas o placas. El método es satisfactorio si se emplean reactivos de determinación del grupo potentes (v. pág. 428). Es preferible un método en tubo con centrifugación inmediata.

Las técnicas de aglutinación (v. cap. 19, pág. 428) empleando un gel de sephadex (DiaMed ID) o una matriz de microesferas de cristal (Ortho BioVue) se emplean de manera creciente para la determinación del grupo, especialmente cuando existen sistemas automatizados; estas técnicas deberían siempre realizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El número de reactivos y controles está limitado a seis, lo que hace imposible la inclusión de dos reactivos anti-D, un control y un grupo inverso además del grupo celular. Hay varios perfiles diferentes para elegir, y algunas tarjetas/casetes incluyen anticuerpos monoclonales frente a otros antígenos del grupo sanguíneo (p. ej., K) además de ABO o D. La determinación globular o sérica del grupo puede hacerse con diferentes tarjetas/casetes.

Método de microplacas en fase líquida La tecnología de microplacas en fase líquida proporciona un método barato y seguro para series de pruebas, cuando se emplea la semiautomatización para la dispensación y lectura; es la técnica de determinación del grupo que con más frecuencia se usa en el Reino Unido. La determinación de los grupos ABO y D puede realizarse en una única microplaca si se emplean reactivos monoclonales. Para la determinación del grupo es recomendable la técnica de resuspensión, empleando microplacas de poliestireno rígidas con pocillos en U no tratados. Si las microplacas se reutilizan deberían lavarse con un detergente suave, aclararse minuciosamente con agua destilada y ser dejarlas secar boca abajo; también podría emplearse un baño ultrasónico. Las placas rayadas o dañadas deberían desecharse. La placa se diseña normalmente como 12 × 8 (12 pruebas y 8 reactivos), pero puede usarse en la dirección opuesta (8 × 12), dependiendo del número de reactivos y controles requeridos. Los reactivos anti-D deberían mantenerse alejados de los reactivos anti-A y anti-B porque pueden producirse salpicaduras entre pocillos cuando se dispensan los reactivos o con el manejo manual de las placas durante la prueba si no se tiene suficiente cuidado. Se recomienda el siguiente método22: 1. Añadir 1 gota de antisuero y diluyente control (si es preciso) a cada pocillo apropiado. 2. Añadir 1 o 2 gotas de plasma/suero problema a los pocillos apropiados para la determinación inversa del grupo y el autocontrol (si es preciso). 3. Hacer una comprobación visual para asegurar que no hay pocillos vacíos. 4. Añadir una gota de una suspensión celular al 3% de las células problemas en el pocillo adecuado que contenga antisuero, diluyente control y autocontrol. 5. Añadir 1 gota de reactivo de eritrocitos al 3% a los pocillos apropiados que contengan el plasma/suero problema. 6. Agitar cuidadosamente para mezclar, preferiblemente empleando un agitador de microplacas. 7. Dejar la placa incubando a temperatura ambiente durante 15 min y centrifugar a 100 g durante 40 s. 8. Resuspender los eritrocitos empleando un agitador de microplacas. La agitación excesiva reduciría la fuerza de aglutinación. Debe recordarse que en los métodos de microplaca los aglutinados formados por algunos tipos más débiles de D débil podrían romperse y ser interpretados como D negativo.

Técnicas en fase sólida La determinación del grupo ABO/D utilizando técnicas en fase sólida debería emplearse como parte de un sistema completamente automatizado y se deberían realizar las pruebas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Controles En cada prueba o batería de pruebas deberían incluirse un control positivo y negativo. El reactivo anti-A debería enfrentarse a células del grupo A (control positivo) y B (control negativo), y el reactivo anti-B a células del grupo B (control positivo) y grupo A (control negativo). En sistemas

Figura 20.5. Tecnología de aglutinación en columna: grupo sanguíneo O D positivo.

20 Aspectos de laboratorio de las transfusiones sanguíneas

Tabla 20.2. Células control para la determinación del grupo sanguíneo

lumnas podría ser mal interpretado como una aglutinación débil por observadores inexpertos (v. fig. 20.6). Los cilindros hemáticos normalmente se dispersan y forman una lámina de células si se añade una gota de solución salina; alternativamente, la determinación indirecta del grupo puede repetirse empleando plasma/suero diluido con solución salina a 1:2 o 1:4.

Reactivo

Control positivo

Control negativo

Anti-A

Células A

Células B

Anti-B

Células B

Células A

Anti-D

Células D positivas

Células D negativas

Células A1

Anti-A

Anti-B

Autoaglutinación por frío y aloanticuerpos que reaccionan al frío

Células B

Anti-B

Anti-A

Los autoanticuerpos fríos que reaccionan a temperatura ambiente pueden producir una autoaglutinación celular (ABO y D) y una aglutinación completa en la prueba sérica de determinación de grupo, causando una determinación anormal del grupo (v. pág. 218). Las pruebas deberían repetirse empleando células lavadas en solución salina y plasma/suero precalentados a 37 °C, incluyendo un autocontrol. Los aloanticuerpos que reaccionan en frío (p. ej., anti-P1) pueden causar aglutinación de las células en la determinación sérica del grupo y si se sospecha su presencia, la prueba debe repetirse empleando plasma/suero precalentado o células para determinación del grupo que carezcan de los antígenos implicados.

completamente automatizados, los controles deberían realizarse al menos dos veces al día, haciéndolos coincidir con el encendido de la máquina y el cambio de reactivos, teniendo en cuenta el tiempo que los reactivos se han mantenido a temperatura ambiente en la máquina. Las muestras control deberían ser cargadas del mismo modo que las muestras problema. En la tabla 20.2 se muestran los controles necesarios. Cuando los controles no dan las reacciones esperadas, debe realizarse un análisis para determinar la validez de todas las pruebas realizadas posteriormente al último resultado con un control válido.

Activación-T/poliaglutinación Causas de discrepancia en la determinación del grupo ABO/D Reacciones falso positivo Formación de pilas de monedas (rouleaux) o cilindros hemáticos

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El fenómeno de la formación rouleaux puede darse en varias situaciones clínicas, en las que la proporción normal del albúmina y globulinas del plasma está alterada (p. ej., mieloma múltiple) y en presencia de sustitutos del plasma, como los dextranos. El apilamiento de los eritrocitos en co-

A

La poliaglutinación23 describe la aglutinación de los eritrocitos por todos o la mayoría de los sueros adultos normales, como consecuencia de anticuerpos IgM que reaccionan con un antígeno desconocido de los eritrocitos. La forma más común es la activación-T, que ocurre cuando la neuraminidasa, producida por bacterias, rompe el ácido N-acetil neuramínico de las membranas de los eritrocitos, exponiendo el antígeno T. Esto puede ser un problema cuando se determina el grupo con reactivos policlonales, que contienen anti-T, y se produce clínicamente más a menudo en recién nacidos y

B

Figura 20.6. Microfotografía de una suspensión de eritrocitos en suero que muestran un grado leve de formación de hematíes en pilas de monedas (rouleaux) (A) y aglutinación débil (B).

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456

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

niños pequeños (p. ej., recién nacidos con enterocolitis necrosante). Las pruebas que emplean reactivos monoclonales no se afectan por este fenómeno. Cuando se sospecha o cuando se ha diagnosticado una enterocolitis necrosante es necesario llevar a cabo pruebas especiales para confirmar la activación T.

Pérdida de potencia El almacenamiento o congelación y descongelación inapropiados pueden causar una pérdida de potencia de los reactivos para la determinación del grupo sanguíneo. El uso frecuente de controles alertará al usuario de este problema.

Error en la identificación de lisis Antígeno B adquirido El antígeno B adquirido se debe normalmente a la desacetilación de los eritrocitos A1 por enzimas bacterianas de eritrocitos. Algunos reactivos anti-B reaccionan fuertemente con los antígenos B adquiridos (p. ej., aquellos derivados del clon ES4)24. Esto suele producir normalmente una discrepancia entre las pruebas globular y sérica de determinación del grupo, lo que podría ser pasado por alto si el anti-B propio del paciente es débil o si se omite la prueba indirecta. Deberían evitarse estos reactivos anti-B.

Potenciadores Los eritrocitos pueden estar cubiertos con IgG como resultado de una sensibilización in vivo. El uso de técnicas potenciadas, como la prueba de antiglobulina para la determinación del D, o de reactivos potenciados para la determinación del grupo ABO o D puede tener como resultado un falso positivo; los últimos pueden además producir una reacción positiva con el diluyente control, pero los datos del NEQAS del Reino Unido25 han mostrado que algunos laboratorios fallan en la inclusión de un control apropiado o en la comprensión del significado de un control positivo. Por esta razón, no es aconsejable el uso de técnicas o reactivos potenciados para la determinación del grupo sanguíneo.

Anticuerpos contaminantes Los reactivos policlonales anti-D eran susceptibles a la contaminación por anticuerpos de otras especificidades que no hubieran sido adecuadamente absorbidos (p. ej., no era infrecuente que un reactivo anti-D se contaminase con anti-A, anti-B o anti-C, conduciendo a resultados falso positivo con eritrocitos A, B o r′, respectivamente).

Contaminación bacteriana in vitro La contaminación bacteriana in vitro de los antisueros, los eritrocitos del paciente o las células de la determinación sérica del grupo puede causar una aglutinación falsamente positiva.

Reacciones falso negativo Fallos al añadir los reactivos La causa más frecuente de una determinación falso negativo del grupo es el error al añadir los reactivos o el plasma/suero problema. Por esta razón, en las pruebas en fase líquida, el suero o plasma debería ser siempre añadido primero al compartimento de reacción y hacer una comprobación visual antes de añadir los eritrocitos. A este respecto, es útil el uso de reactivos con códigos de color para la determinación del grupo ABO.

En presencia de complemento, anti-A y anti-B pueden causar lisis in vitro de los eritrocitos de control. Si la lisis no se reconoce como una reacción positiva, los resultados pueden leerse como falsamente negativos en la prueba indirecta o sérica de la determinación de grupo. Para evitar esto, las células de la determinación inversa del grupo deberían resuspenderse en solución salina con EDTA, si se usa plasma en lugar de suero (v. fig. 20.4).

Aspecto de campo mixto En la determinación de los grupos ABO y D puede aparecer una población dual de eritrocitos. Es importante reconocer esto como una imagen de campo mixto y no confundirlo con una aglutinación débil. La causa más probable de una imagen de campo heterogéneo es la transfusión (tanto deliberada como accidental) de eritrocitos no idénticos en los grupos ABO o D. Se requieren análisis para determinar el grupo sanguíneo real del paciente, que podría haber sido transfundido en una institución diferente o podría haber recibido una transfusión intrauterina. Un grupo ABO con campo mixto podría ser el primer indicador de una transfusión previa con incompatibilidad ABO. Un trasplante de médula ósea con incompatibilidad ABO o D podría producir una imagen de campo mixto hasta que se produce la total implantación del injerto; la imagen de campo mixto puede posteriormente reaparecer cuando un implante está fallando. En raras ocasiones, la población dual de células es permanente y es el resultado de un subgrupo débil de A (A3) o un grupo sanguíneo quimérico. La interpretación de las poblaciones duales de eritrocitos dependerá de la técnica usada. En un tubo, la lectura microscópica revelará fuertes aglutinados en un mar de células libres; en las técnicas de aglutinación en columna habrá una línea de células aglutinadas en lo alto de la columna, con las células negativas moviéndose por la parte baja de la columna. Los sistemas automáticos deberían estar programados para detectar imágenes de campos mixtos.

Variantes fenotípicas D Los resultados discrepantes entre diferentes reactivos antiD o resultados débiles son generalmente el resultado de fenotipos D débiles o parciales. En el D débil está presente el antígeno D completo, pero con menos puntos de antígeno D por célula. Los pacientes con D débil son incapaces de formar anti-D y podrían ser tratados como D positivos. Sin embargo, una reacción débil con un único reactivo anti-D debería ser evaluada con un segundo anti-D antes de asignar el resultado como D positivo. Es esencial ser capaz de distinguir entre una reacción débil y una reacción de campo mixto, porque este último caso podría conducir a la

20 Aspectos de laboratorio de las transfusiones sanguíneas

transfusión a un paciente D negativo con sangre D positiva. Ante la duda es más seguro considerar al paciente como D negativo, al menos hasta que se hayan realizado investigaciones en el centro de referencia. Con ello no habría consecuencias clínicas, porque es seguro transfundir sangre D negativa a un paciente D positivo y es improbable que la inyección de anti-D profiláctica a una mujer embarazada D positiva sea perjudicial. La mayoría de las formas débiles D son D positivos con los reactivos comerciales anti-D monoclonales de alta afinidad que se usan actualmente. Cuando se obtienen reacciones diferentes con dos reactivos distintos, el paciente podría ser un D parcial (p. ej., cuando se han perdido uno o más epítopos del antígeno D). Estos individuos son capaces de formar anti-D tras sensibilización con el epítopo ausente. La variante Da carece de la mayoría de los epítopos, y es probable que estos individuos formen anti-D cuando son estimulados por transfusión o embarazo. Por esta razón, los reactivos anti-D para la determinación rutinaria del grupo de muestras de pacientes no deberían detectar DVI. Hay pocas pruebas que sugieran que un donante DVI podría desencadenar una respuesta inmune en un receptor D negativo; sin embargo, un donante D positivo débil, incluyendo donantes DVI, debería clasificarse como D positivo. Hay algunas diferencias étnicas importantes en la frecuencia de diferentes haplotipos Rh, como se muestra en la tabla 20.3.

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DETECCIÓN DE ANTICUERPOS La detección de anticuerpos se suele realizar al mismo tiempo que la determinación del grupo sanguíneo y antes de la selección de las unidades de sangre para la transfusión. La identificación de anticuerpos puede ser más real y sensible que las pruebas cruzadas contra las células del donante porque algunos anticuerpos reaccionan con más fuerza con eritrocitos con expresión homocigota (dosis doble) de los antígenos relevantes que con los de expresión heterocigota (dosis simple): especialmente anti-Jka/Jkb pero también anti-Fya, -Fyb, -S, y –s. Las células seleccionadas puede elegirse para reflejar esto, mientras que las células de la unidad donada son normalmente de cigosidad desconocida. Además, los eritrocitos empleados para detectar la presencia de anticuerpos irregulares son más fáciles de estandarizar que las células de la donación, y potencialmente hay menos posibilidades de error en el procedimiento, particularmente al utilizar sistemas automáticos. Los anticuerpos clínicamente significativos son aquellos capaces de causar morbilidad al paciente como resultado de una destrucción acelerada de una proporción significativa de las células transfundidas. Con pocas excepciones, los anticuerpos clínicamente significativos son aquellos que reaccionan en la prueba de antiglobulina indirecta a 37 °C; sin embargo, no es posible predecir serológicamena La determinación del genotipo del ADN del glóbulo rojo puede cambiar nuestra definición de D débil y parcial.

Tabla 20.3. Frecuencias aproximadas de haplotipos comunes en poblaciones seleccionadas26 Frecuencia aproximada Haplotipo

Inglesa

Nigeriana

China

DCe R

0,421

0,060

0,730

dce r

0,389

0,203

0,023

DcE R2

0,141

0,115

0,187

Dce R0

0,026

0,591

0,033

dcE r’’

0,012

0

0

dCe r’

0,010

0,031

0,019

1

te cuáles de estos anticuerpos tendrán significación clínica definitiva, por lo que suele emplearse el término «de significación clínica potencial».

Panel de hematíes El plasma o suero del paciente debería enfrentarse al menos a dos tipos de células de cribado, estudiadas por separado y no agrupadas. Las células de cribado deben ser del grupo O y abarcar los antígenos más frecuentes en la población autóctona. En el Reino Unido, deberían expresarse como mínimo los siguientes antígenos: C, c, D, E, e, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, M, N y Lea; una célula debería ser R2R2 y otra R1R1 o R1wR1. Los siguientes fenotipos también deberían estar representados en el conjunto de selección: Jk(a+b–), Jk(a–b+), S+s–, S–s+, Fy(a+b–) y Fy(a–b+) (v. tabla 20.4). Estas recomendaciones para homocigosidad están basadas en datos del Reino Unido acerca de la incidencia de reacciones transfusionales hemolíticas tardías, la necesidad de una mayor sensibilidad en la detección de anticuerpos Kidd y el bajo rendimiento de las técnicas de aglutinación en columna en la detección de algunos ejemplos de anticuerpos Kidd empleando células heterocigotas2,26. Los requerimientos para la expresión de antígenos Cw y Kpa en las células de detección han sido causa de muchos debates, y realmente no hay un consenso internacional. En el Reino Unido y en los Estados Unidos no se requiere la detección de anti-Cw o anti-Kpa incluso en ausencia de una prueba cruzada con antiglobulina9,27. Ello es debido a que son antígenos de baja frecuencia y los anticuerpos rara vez causan una reacción transfusional hemolítica tardía o enfermedad hemolítica grave del recién nacido.

Métodos La evaluación de anticuerpos siempre debería realizarse mediante una prueba de antiglobulina indirecta como método primario. También pueden usarse métodos adicionales (p. ej., enzimáticos en dos fases o Polibreno) pero son peores para la detección de algunos anticuerpos clínicamente significativos y no deberían usarse de forma aislada. Un gran estudio retrospectivo mostraba que la gran mayoría de

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458

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tabla 20.4. Expresión de los antígenos de los eitrocitos en el panel de hematíes9 Sistema del grupo sanguíneo

Antígeno

Células hemocigotas recomendadas

Rh

C

Sí (R1R1 o R1WR1)

c

Sí (R2R2)

D

Sí (R1R1 y R2R2)

E

Sí (R2R2)

e

Sí (R1R1 o R1WR1)

K

Noa

k

No (probablemente siempre)

Kell

Duffy

Fya

Sí

b

Sí

a

Jk

Sí

Jkb

Sí

M

No

N

No

S

Sí

s

Sí

Lea

No

Fy Kidd

MNSs

Lewis a

Aunque deseable, es improbable que se encuentren células KK.

anticuerpos detectados sólo por una técnica enzimática no son clínicamente significativos28. En el estudio de Issitt, llevado a cabo con 10.000 pacientes recientemente transfundidos, sólo un anti-c inicialmente no reactivo por la prueba de antiglobulina indirecta causó una reacción transfusional hemolítica retardada. Ha habido sólo un informe de un anti-E, que sólo era detectable por la prueba de antiglobulina indirecta postransfusional, que provocó una reacción transfusional hemolítica retardada1. Para las técnicas en fase líquida, la guía del BCSH recomienda el uso de eritrocitos suspendidos en LISS, más que en solución salina estándar con fuerza iónica normal, porque el LISS incrementa la sensibilidad de detección de muchos anticuerpos potencialmente significativos desde el punto de vista clínico9,25. Hay informes conflictivos sobre si se puede mejorar la sensibilidad añadiendo polietilenglicol29,30.

Técnicas de antiglobulina indirecta

ro y reactivos, la fase de lectura es más objetiva y es fácil de automatizar. La antiglobulina humana (AGH) incorporada en la matriz está disponible como un reactivo poliespecífico o anti-IgG. Las concentraciones de los eritrocitos y los volúmenes pueden ser críticos y es importante seguir las instrucciones del fabricante en todo momento. De manera similar, también se dispone de microcolumnas que emplean una matriz de gel de afinidad, a la que se incorporan la proteína G y la proteína A, más que el anti-IgG. Se ha demostrado que las pruebas cruzadas en columnas de aglutinación son menos sensibles que las técnicas estándar en tubo para la detección del los anticuerpos ABO débiles como anti-A con células A2B25,32,33 y anticuerpos Kidd con eritrocitos heterocigotos25. Se ha sugerido que estos fallos podrían ser el resultado de fuerzas de cizallamiento que se producen durante la centrifugación, que causan que los aglutinados débiles se rompan, especialmente cuando la densidad del antígeno es baja32.

Sistemas en fase sólida Las técnicas en fase sólida (p. ej., Capture-R [Immucor] y Solid Screen II [Biotest]) también se han hecho más populares porque se ha demostrado que tienen un alto nivel de sensibilidad y se prestan a la automatización completa30.

Técnicas en fase líquida: tubos y microplacas Las técnicas en tubo se usan todavía para la detección de anticuerpos en algunas partes del mundo. Con las técnicas de suspensión en LISS es importante mantener una alta proporción suero:células, sin afectar a la fuerza iónica. Con volúmenes iguales de suero y suspensiones celulares en LISS al 1,5-2%34 se consigue una proporción suero:células mayor de 60:1, lo que asegura una sensibilidad óptima. Los reactivos deben incubarse durante 15-20 min a 37 °C y seguidamente las células serán lavadas con PBS. Después de añadir AGH, los eritrocitos deberían ser examinados usando un cuidadoso procedimiento de «inclinación y rotación» para prevenir la ruptura de los aglutinados débiles. También pueden emplearse en esta técnica facilitadores de lectura como una caja de luz o un espejo cóncavo. La tecnología de microplacas en fase líquida nunca ha alcanzado una enorme popularidad para la detección de anticuerpos porque es relativamente difícil de introducir y estandarizar y no puede ser automatizada. No se detalla ningún método aquí, porque cada vez es más difícil obtener reactivos estandarizados AGH para uso en microplacas. Sin embargo, existe más información disponible en las guías del BCSH, incluyendo un método recomendado para la detección en placa con pocillos en V, usando una técnica de extensión9.

Aglutinación en columnas

Controles

En muchos países actualmente se usa más la aglutinación en columna que las técnicas tradicionales en tubo o microplacas en fase líquida porque se ha demostrado que es al menos tan sensible como una técnica estándar en tubo con LISS30,31, es más simple de desarrollar porque no requiere fase de lavado, emplea menores volúmenes de plasma/sue-

Debería usarse un anti-D débil de manera regular para asegurar la eficacia del procedimiento completo, aunque la frecuencia exacta dependerá de los patrones de trabajo, como se describe en la sección de la determinación del grupo sanguíneo. También se recomienda el empleo de controles débiles adicionales para confirmar la sensibilidad del

20 Aspectos de laboratorio de las transfusiones sanguíneas

procedimiento y la integridad de los antígenos de los eritrocitos durante su vida útil; los anti-Fya y/o anti-S son buenos ejemplos, porque los antígenos Duffy y S son lábiles y pueden deteriorarse más rápidamente sobre las células reactivas que el antígeno D, y su uso también asegurará que las células tratadas con enzimas no se han usado por error. Debería estudiarse la selección de controles que demuestren que se han añadido las células de detección correctas a la batería de pruebas. El empleo de eritrocitos débilmente sensibilizados con anti-D es esencial para controlar la fase de lavado de todas las pruebas de fase líquida negativas, porque el lavado inadecuado puede conducir a una neutralización completa o parcial de las AGH por globulinas no fijadas. Cualquier prueba que no dé una reacción positiva con la fuerza esperada, tras la adición de estas células (y subsiguiente centrifugación), indica insuficiente anti-IgG libre y debería repetirse. La fase de lavado de los sistemas en fase sólida es difícil de controlar y podría ser necesario añadir un control débil a cada columna para asegurar que todas las sondas han dispensado solución salina durante cada ciclo de lavado.

IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS Cuando se detecta un anticuerpo en la fase de cribado, debería determinarse su especificidad y valorarse su probable significación clínica antes de seleccionar la sangre para transfusión o dar consejos relevantes durante el embarazo. Es esencial un enfoque sistemático de la identificación del anticuerpo para asegurar que se identifican todas las especificidades de potencial significado clínico. Podría ser tentador encajar un patrón de reacción inmediatamente y no buscar más, pero es probable que ello conduzca a la ausencia de identificación de especificidades adicionales.

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Principios Como punto de inicio, el plasma/suero problema debería enfrentarse a un panel de identificación de eritrocitos de fenotipo conocido mediante la técnica con la que fue detectado en la prueba de detección. La siguiente sección sobre reactivos resume los requerimientos mínimos para el panel. La inclusión de una prueba de autoanticuerpos es útil para distinguir entre un autoanticuerpo, un anticuerpo dirigido contra un antígeno de alta frecuencia y una compleja mezcla de aloanticuerpos. Las reacciones positivas y negativas deberían ser comparadas con el perfil del panel, en conjunción con los resultados de la prueba de detección. Cada especificidad del anticuerpo debería valorarse individualmente, y su presencia debería excluirse sistemáticamente por identificación de células antígeno positivas que han dado reacciones negativas; cuando sea posible debería obtenerse una reacción negativa con un glóbulo rojo con expresión homocigota del antígeno relevante; por ejemplo, si se ha obtenido una reacción negativa contra una célula Jk(a+b–), puede excluirse la presencia de anti-Jka, pero cuando las reacciones negativas son sólo contra células

Jk(a+b+), entonces no se puede excluir inmediatamente de manera segura el anti-Jka. Esto dejará una lista de especificidades potenciales, que deberían ser consideradas por compatibilidad de las reacciones positivas con las células portadoras del antígeno o positivas, para determinar cuál se encuentra realmente en la célula. Una vez se completa este proceso con el panel inicial de detección e identificación, podría ser necesario utilizar más células y técnicas para completar el proceso de exclusión (p. ej., cuando se ha identificado la presencia de anti-S, puede ser necesario un panel tratado con enzimas para excluir la presencia de anti-E, cuando todas las células E positivas fueron también S positivas, o podría ser necesario seleccionar unas células K+S– para excluir la presencia de anti-K). Cuantas más especificidades existan, más complicado será el proceso y, si los recursos son limitados, podría ser necesario enviar las muestras a un centro de referencia para aclarar todas las especificidades. Si se dispone de antisueros, la determinación del fenotipo de los eritrocitos del paciente de manera precoz permitirá la exclusión de especificidades para las que el paciente es antígeno positivo. La especificidad de un anticuerpo debería sólo asignarse cuando reacciona con al menos dos muestras de eritrocitos reactivos que contengan el antígeno y no reacciona con al menos dos muestras de eritrocitos reactivos que carezcan del antígeno. Esto se debe a que podría producirse una única reacción positiva si el panel de células inesperadamente expresa un antígeno de baja frecuencia, y podría ocurrir una única reacción negativa si las células del panel carecieran de un antígeno de alta frecuencia.

Determinación del fenotipo Cuando se identifica un anticuerpo, debería determinarse el fenotipo de los eritrocitos propios del paciente para el antígeno relevante. Si los eritrocitos del paciente son negativos para los antígenos, se confirma que el paciente es capaz de generar anticuerpos de una particular especificidad. Si los eritrocitos del paciente son positivos para el anticuerpo, ello sugiere una de las siguientes opciones: 1. El anticuerpo es un autoanticuerpo, en cuyo caso la prueba de antiglobulina directa debería ser positiva. 2. Los eritrocitos están recubiertos de anticuerpos y se ha empleado un método potenciado para determinar el fenotipo, invalidando de esta manera el resultado. 3. El resultado de la identificación inicial es incorrecto. La determinación ampliada del fenotipo puede ser útil cuando existe una mezcla de anticuerpos porque permitirá la exclusión de anticuerpos específicos para antígenos para los que el paciente es positivo, reduciendo el número requerido de células reactivas adicionales.

Paneles y técnicas adicionales La probabilidad de identificar anticuerpos cuando existen dos especificidades mejora significativamente mediante el

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460

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

uso de técnicas enzimáticas en dos fases, siempre que al menos uno de los antígenos relevantes se afecte por enzimas25 (p. ej., los anticuerpos Rh son potenciados por las enzimas proteolíticas, mientras que los antígenos M, N, S, Fya y Fyb son destruidos por estas mismas enzimas). De manera similar, cuando se ha identificado una mezcla de dos anticuerpos, dos paneles diferentes de células fenotipadas proporcionan una mayor probabilidad de excluir especificidades adicionales. La aglutinación directa a temperatura ambiente o a 4 °C puede ser útil para distinguir entre un anticuerpo de potencial significación clínica y un anticuerpo que reaccione en frío; de nuevo, esto es particularmente útil cuando hay una mezcla de anticuerpos. Casos débiles de anticuerpos Kidd a menudo se potencian con el uso de una prueba de antiglobulina indirecta, empleando células tratadas con enzimas, lo que puede ser particularmente útil cuando en esta prueba el anticuerpo reacciona sólo contra células homocigotas en la prueba de antiglobulina indirecta.

Reactivos Un panel de identificación debería constar de eritrocitos de al menos ocho donantes del grupo O, aunque en los paneles comerciales son más frecuentes diez, lo que permite una más fácil interpretación de la mezcla de anticuerpos. Para ser funcional, el panel debe permitir una identificación segura de los anticuerpos clínicamente significativos más frecuentemente encontrados. Las guías del Reino Unido9 pueden resumirse de la siguiente manera: 1. Por cada anticuerpo antieritrocitario clínicamente significativo de detección frecuente, deberían haber al menos dos muestras carentes del antígeno y al menos dos muestras portadoras del antígeno correspondiente. 2. Al menos debería haber dos muestras de cada unos de los fenotipos R1R1 y R1wR1. Entre ellos, estas dos muestras deberían expresar los antígenos K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S, y s. 3. Debería haber al menos una muestra de los fenotipos R2R2, r′r y r′′r y al menos dos muestras del fenotipo rr. 4. Los siguientes fenotipos deberían ser expresados en muestras carentes de antígenos D y C: K+, K–, Jk(a+b–), Jk(a–b+), S+s–, S–s+, Fy(a+b–) y Fy(a–b+). El panel debería ser capaz de resolver tantas mezclas de anticuerpos como sea posible.

Tarjetas de anticuerpos Las reacciones transfusionales hemolíticas tardías pueden ocurrir cuando no se detectan anticuerpos o se han identificado incorrectamente, a menudo por una institución diferente1,2. Se ha sugerido que las tarjetas de anticuerpos emitidas por el hospital o el centro de referencia deberían ser llevadas por el paciente para su presentación al ingreso en el hospital. Para ser efectivas, las tarjetas deberían ir acompañadas de un impreso con información sobre el paciente, explicando la significación de los anticuerpos, y ser preferiblemente entregada personalmente al paciente por alguien con claros conocimientos sobre práctica transfu-

sional. Hay obstáculos potenciales a esta sugerencia, sobre todo cuando el nivel de destreza en la identificación de anticuerpos y en la apreciación de su significado clínico varía entre instituciones. Una estrategia mejor podría tener una base de datos nacional que incluyera la presencia de anticuerpos clínicamente significativos.

SELECCIÓN Y TRANSFUSIÓN DE ERITROCITOS Una vez que se ha determinado el grupo sanguíneo del paciente e identificado los anticuerpos, se requiere una serie de procedimientos para seleccionar las unidades de eritrocitos que son adecuadas para la transfusión. Éstas incluyen la selección de unidades ABO/D compatibles, que necesitan también ser negativas para los antígenos frente a los que el paciente tiene aloanticuerpos antieritrocitarios clínicamente significativos (v. tabla 20.5); sin embargo, es importante que se incluya una selección basada en ciertos criterios clínicos (p. ej., los requerimientos de eritrocitos CMV negativos, irradiados o lavados). La selección de acuerdo a estos criterios depende de una correcta información clínica, una precisa determinación del grupo sanguíneo ABO y D y una sensible prueba de detección de anticuerpos. Algunos pacientes precisan la transfusión de sangre de manera definitiva, mientras que otros podrían someterse a una cirugía en la que se cruza la sangre sólo para estar «preparados» frente a cualquier posible eventualidad. Las auditorías han mostrado que la sangre se cruza a menudo pero no es transfundida. La proporción de transfusiones o índice de pruebas cruzadas puede ser usada para valorar lo bien que se manejan las reservas de sangre. Una opción es realizar un grupo sanguíneo del paciente y la detección de anticuerpos y reservar la muestra y sólo realizar las pruebas cruzadas si se encuentran ciertas indicaciones prefijadas para llevar a cabo las transfusiones. La política local debería definir un máximo de requerimientos de sangre para la programación quirúrgica, indicando qué procedimientos quirúrgicos pueden ser «grupo y detección/grupo y reserva» y cuántas unidades de sangre deben ser cruzadas para procedimientos con una elevada probabilidad de transfusión intraoperatoria35. La decisión de qué categoría se elige puede relacionarse con factores locales incluyendo la proximidad del centro de transfusiones sanguíneas a los quirófanos (u otra localización donde se transfunde la sangre) y el tiempo que lleva proporcionar sangre compatible tras una petición. Una vez se han seleccionado los eritrocitos apropiados, se necesita asegurar su compatibilidad. Esto se refiere normalmente a las pruebas cruzadas, que pueden incluir una prueba de antiglobulina indirecta para comprobar la incompatibilidad como resultado de anticuerpos IgG y anticuerpos ABO o una prueba de centrifugación inmediata para comprobar sólo incompatibilidad ABO. En lugar de pruebas serológicas, la evaluación de la compatibilidad ABO puede basarse en un «control informático», usualmente llamado una «prueba cruzada electrónica». Algunos laboratorios de transfusiones, cuando la cirugía se realiza en un hospital diferente, han extendido la prueba cruzada electrónica a la selec-

20 Aspectos de laboratorio de las transfusiones sanguíneas

Tabla 20.5.

Recomendaciones para la selección de sangre para un paciente con anticuerpos antieritrocitarios9

Sistema

Anticuerpo

Recomendación

ABO

Anti-A1

PAI cruzada compatible a 37 °C

Rh

Anti-D, -C, -c, -E, -e

Antígeno negativoa

Rh

Anti-Cw

PAI cruzada compatibleb

Kell

Anti-K, -k

Antígeno negativoa

Kell

Anti-Kpa

PAI cruzada compatibleb

Kidd

Anti-Jka, -Jkb

Antígeno negativoa

MNS

Anti-M (activo a 37 °C)

Antígeno negativoa

MNS

Anti-M (no activo a 37 °C)

PAI cruzada compatible a 37 °C

MNS

Anti-N

PAI cruzada compatible a 37 °C

MNS

Anti-S, -s, -U

Antígeno negativoa

Duffy

Anti-Fya, -Fyb

Antígeno negativoa

P

Anti-P1

PAI cruzada compatible a 37 °C

Lewis

Anti-Lea, -Leb, Lea+b

PAI cruzada compatible a 37 °C

Lutheran

Anti-Lua

PAI cruzada compatible a 37 °C

a

Diego

Anti-Wr (anti-Di3)

PAI cruzada compatibleb

H

Anti-HI (en pacientes A1 y A1B)

PAI cruzada compatible a 37 °C

Todos

Otros activos por PAI a 37 °C

Pedir consejo al banco de sangre

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Esta guía es útil para pacientes con hipotermia durante la cirugía26. a Antígeno negativo y pruebas cruzadas compatibles. b Estas recomendaciones son aplicables cuando el anticuerpo está presente como una única especificidad. Si se presenta en combinación, sangre antígeno-negativa debe ser proporcionada por el banco de sangre para prevenir pérdidas de unidades con determinación del fenotipo. Mollison y cols., 1993. Blood Transfusion in Clinical Practice. Blackwell, Oxford. PAI, prueba de antiglobulina indirecta.

ción de unidades compatibles, ordenada por el centro de transfusiones, desde una nevera remota. El proceso de las pruebas cruzadas sanguíneas tiene por objeto evitar la transfusión de hematíes incompatibles y la subsiguiente reacción hemolítica transfusional. Los diferentes tipos de prueba cruzada se resumen en los párrafos siguientes. Con cualquier técnica de pruebas cruzadas que se elija, debe quedar claro que en todos los pacientes con anticuerpos antieritrocitarios conocidos, aunque sean actualmente indetectables, debería hacerse una prueba de compatibilidad con antiglobulina y que estos pacientes no deben incluirse en la estrategia «grupo prueba cruzada/unidad reservada» o para la prueba cruzada electrónica9,15.

PRUEBAS CRUZADAS

Elección de la técnica Prueba cruzada con antiglobulina indirecta Los argumentos para mantener la prueba cruzada con antiglobulina indirecta se basan en el fallo en la identifica-

ción de anticuerpos contra antígenos de baja frecuencia en la prueba de detección de anticuerpos. Sin embargo, existen evidencias resumidas por Garratty27 de que la probabilidad de no detectar un anticuerpo clínicamente significativo es de alrededor de 1 entre 10.615 pruebas cruzadas, si se omite el componente de la prueba de la antiglobulina indirecta y la detección de anticuerpos depende sólo de una detección de anticuerpos sensibles. Además, el desenlace habitual de una transfusión, si existía un anticuerpo y no se detectó por la prueba de detección anticuerpos, se limita a una reducción de la supervivencia de los eritrocitos. Sin embargo, siempre debería realizarse una prueba de compatibilidad de antiglobulina indirecta si el paciente tiene anticuerpos antieritrocitarios de probable significado clínico, incluso si no son detectables actualmente. Las razones para ello son las siguientes: 1. Actúa como una doble comprobación de que el fenotipo de la donación ha sido determinado correctamente y la sangre etiquetada como negativa para el o los correspondientes antígenos también.

461

462

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

2. Asegura la compatibilidad serológica, incluso si la identificación del o de los anticuerpos es incorrecta o incompleta. 3. Permite la detección de anticuerpos para antígenos de baja frecuencia no presentes en las células de detección, que podrían encontrarse quizás en un paciente que es claramente un «respondedor» y que podrían quedar enmascarados por otros aloanticuerpos. Otras circunstancias en que se debería realizar una prueba cruzada de antiglobulinas indirecta son las siguientes: 1. El paciente ha tenido un trasplante de órgano sólido con incompatibilidad ABO y debe transfundirse en los 3 meses tras el trasplante; esto es necesario para detectar IgG anti-A o anti-B que podrían producirse a partir de linfocitos «pasajeros» del órgano trasplantado36. 2. El paciente tiene un aloanticuerpo de baja significación clínica detectable en la detección rutinaria de anticuerpos; en este caso la sangre podría ser administrada si hay compatibilidad en la prueba de compatibilidad con antiglobulina desarrollada estrictamente a 37 °C, sin necesidad de sangre negativa para el antígeno (v. tabla 20.5). Los métodos para las pruebas cruzadas con antiglobulina indirecta son los mismos que los empleados para la detección de anticuerpos. Las pruebas cruzadas pueden ser menos efectivas que la detección de anticuerpos para identificar incompatibilidad debida a anticuerpos IgG. Esto se debe parcialmente a que las células pueden mostrar sólo expresión heterocigota de un antígeno frente al que el paciente tiene un anticuerpo, conduciendo, potencialmente, a reacciones más débiles o negativas, y también a que las suspensiones celulares y otras técnicas (p. ej., muestras de la bolsa de donación, etiquetado de tubos, células lavadas, etcétera) son más difíciles de estandarizar y tienen más probabilidades de errores de transposición que los procesos de detección.

Prueba cruzada de centrifugación inmediata El único propósito de esta técnica es detectar la incompatibilidad ABO. Puede emplearse a fin de suministrar la sangre para una transfusión cuando el paciente tiene un grupo sanguíneo completo y detección de anticuerpos negativa. Puede usarse para cambiar de grupo de prioridad y reservar/cruzar cuando se pide la sangre y se suele asociar a una prueba cruzada con antiglobulina. La prueba cruzada de centrifugación inmediata asegurará que se han seleccionado las unidades correctas y que a la unidad de eritrocitos del donante le ha sido asignado el grupo ABO correcto. Claramente, no es una prueba útil para usar en la detección de incompatibilidad ABO si la prueba sérica de determinación del grupo sanguíneo revela unos anti-A o anti-B muy débiles, o si el paciente pertenece a una de las categorías descritas en la sección previa. Hay indicios de que esta técnica está poco estandarizada37, pero su sensibilidad puede optimizarse seleccionando

suspensiones celulares, tiempos de incubación y proporción suero:células apropiadas. Se recomienda el siguiente método en tubo: 1. Mezclar 2 volúmenes de plasma/suero con un volumen al 2-3% de células suspendidas en PBS o LISS (o EDTA salino si se emplea suero; v. fig. 20.4). 2. Incubar a temperatura ambiente durante 2-5 min para potenciar la detección de anticuerpos ABO débiles. 3. Leer la reacción cuidadosamente empleando una técnica de «inclinación y rotación».

Resultados falso negativo La incompatibilidad entre las células donantes A2B y el suero del grupo B del paciente no se detecta de forma fiel con esta técnica38. Tiene aún más importancia el fallo potencial de la aglutinación con anticuerpos ABO39,40 potentes, a causa de una rápida fijación del complemento que fija C1 y que interfiere con la aglutinación: si se usa suero, los eritrocitos deben suspenderse en solución salina con EDTA (fig. 20.4).

Resultados falso positivo Los anticuerpos diferentes a los anti-A y anti-B y que reaccionan en frío pueden causar aglutinación en una prueba cruzada de centrifugación inmediata. Esto puede potencialmente causar un retraso en la transfusión mientras se realizan procedimientos adicionales para descartar la incompatibilidad ABO.

Prueba cruzada electrónica En muchos países la prueba cruzada electrónica se usa habitualmente como una alternativa a la prueba cruzada de centrifugación inmediata, para distribuir la sangre para transfusiones cuando el paciente tiene un grupo sanguíneo completo y no tiene antecedentes de anticuerpos clínicamente significativos. Se seleccionan las unidades ABO y D compatibles y se distribuyen a través de un sistema informático que contiene reglas lógicas para prevenir la dispensación de sangre con incompatibilidad ABO y D. Tanto la guía del BCSH15 como los estándares AABB41 requieren que existan determinaciones concordantes del grupo ABO y D del paciente en al menos dos muestras separadas, al menos una de las cuales debe ser actual. Además, no debe haber detección de anticuerpos clínicamente significativos, ni registro de que se hayan detectado previamente. Las recomendaciones de la AABB indican que se vuelva a comprobar el grupo de la unidad del donante, pero el BCSH acepta una verificación escrita de la exactitud de la etiqueta de la unidad donante por parte del servicio de transfusión que proporciona la sangre. Es altamente recomendado por el BCSH que los procedimientos para la determinación del grupo ABO y D estén automatizados con identificación positiva de la muestra (p. ej., códigos de barras) y transferencia electrónica de los resultados desde el analizador al ordenador del centro de transfusiones, mientras que la AABB no tiene tales requerimientos. Idealmente, los algoritmos informáticos dirigi-

20 Aspectos de laboratorio de las transfusiones sanguíneas

rían el procedimiento, permitiendo sólo la distribución si todos lo criterios son completados: por ejemplo, la distribución de eritrocitos para transfusiones se detendría si sólo existiera un grupo ABO y D en el archivo o si el grupo previo y el actual no coincidieran. El control manual de cualquier parte del proceso incrementa el riesgo de error. La prueba cruzada electrónica, basada en sistemas completamente validados, se ha implantado en varios países desde hace tiempo y se ha probado que es clínicamente segura, siempre que se mantengan las recomendaciones y se sigan estrictamente42–44.

Selección de unidades Algunos hospitales proporcionan una o dos unidades de hematíes del grupo O y D negativo para uso por los clínicos, a la espera de la disponibilidad de hematíes con compatibilidad ABO y D específica. Debido a la relativamente escasa reserva de hematíes de grupo O y D negativos (sólo el 8% de los donantes de sangre caucásicos son O y D negativos), en el Reino Unido el National Blood Service ha distribuido guías en los hospitales45 sobre las restricciones en el uso de eritrocitos O y D negativos en pacientes de otros grupos sanguíneos.

Pruebas de compatibilidad TRANSFUSIONES URGENTES En emergencias clínicas en que se requiere soporte inmediato con hematíes, puede no haber tiempo para las pruebas completas de compatibilidad. Se emplean tanto pruebas abreviadas y técnicas rápidas como la administración de células del grupo sanguíneo O. Debe existir un procedimiento documentado para que haya acuerdo en las emergencias. La política local en este tema debería formalmente valorar el riesgo y proporcionar una formación adecuada al personal, particularmente a aquellos que se encargan del servicio fuera de las horas habituales del laboratorio. El personal de guardia debería ser incluido en las pruebas internas de capacitación, así como en ejercicios de valoración externa de la calidad designada a evaluar las técnicas y las pruebas de emergencia. El centro de transfusiones debería estar implicado en el desarrollo de procedimientos de emergencia en el hospital, incluido el plan de accidentes graves. Todo el personal debería recibir un entrenamiento regular y debería participar en ejercicios prácticos de emergencias. La comunicación es la clave del éxito en el suministro de productos sanguíneos en una emergencia, y el centro de transfusiones necesita estar completamente informado sobre el estado actual del paciente o pacientes para proporcionar un servicio eficiente y oportuno.

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Determinación rápida de los grupos ABO y D En una emergencia debe obtenerse una muestra de sangre previa a la transfusión y el grupo sanguíneo ABO y D del paciente debería determinarse tan rápidamente como fuera posible usando las técnicas ya descritas. Las pruebas en tubo y portaobjetos son las más adecuadas.

Confirmación Antes de la distribución de sangre de un grupo ABO apropiado, debería realizarse en la muestra una prueba sérica, repetir el grupo hemático o llevar a cabo una prueba de compatibilidad inmediata por centrifugación. Los grupos ABO y D deben siempre confirmarse por una prueba adicional en una segunda alícuota de la muestra. Si se ha proporcionado una muestra inadecuadamente etiquetada, deberían distribuirse unidades del grupo O hasta que pueda analizarse una muestra adicional.

Se pueden distribuir unidades específicas para el grupo sanguíneo tras una prueba de compatibilidad inmediata por centrifugación para comprobar la compatibilidad ABO o, si se dispone de más tiempo, una prueba cruzada con antiglobulina en LISS y detección de anticuerpos irregulares. Si no se realizan pruebas cruzadas, debe comprobarse el grupo de las unidades, a menos que el proveedor haya confirmado la confianza en la validez del etiquetado de la unidad donada. Las unidades distribuidas tras pruebas abreviadas deberían ser etiquetadas como tales (p. ej., «seleccionada para el paciente… pero no cruzada»). Se deberían extraer células de la unidad donada antes de su dispensación para poder permitir las pruebas cruzadas retrospectivas, que siempre pueden realizarse, pero sólo son necesarias si la detección de anticuerpos irregulares ha sido positiva.

Detección de anticuerpos La buena práctica requiere una detección de anticuerpos y pruebas de compatibilidad simultáneas y la identificación del anticuerpo si la detección es positiva. Si se han distribuido unidades específicas de grupo sin una prueba de compatibilidad de anticuerpos indirecta (o pruebas de compatibilidad con antiglobulinas), debería realizarse una detección de anticuerpos tan pronto como sea posible. Si la detección de anticuerpos es negativa, no es necesario realizar pruebas cruzadas retrospectivas. No es aceptable realizar unas pruebas cruzadas y no realizar una detección de anticuerpos. Cualquier unidad incompatible no transfundida debe ser retirada tan pronto como sea posible.

Transfusión masiva Se define transfusión masiva como la administración de más de un volumen sanguíneo en 24 h, lo que generalmente significa de media 8-10 unidades para un adulto46. Después de la transfusión de este volumen no es necesario realizar una prueba cruzada con antiglobulinas, pero se recomienda una prueba cruzada con centrifugación inmediata para comprobar la compatibilidad ABO o la confirmación electrónica. Si inicialmente se administró sangre no idéntica, tan pronto como sea posible tras la primera transfusión, debería emplearse sangre del mismo grupo del paciente. En algunas situaciones las necesidades de eritrocitos del receptor podrían requerir el uso de unidades in-

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

compatibles, pero esta decisión clínica basada en la necesidad de sangre debe sopesarse con la significación clínica conocida de los anticuerpos antieritrocitarios detectados.

Selección de plaquetas y plasma En situaciones de transfusión masiva pueden requerirse otros productos sanguíneos, y el empleo de plaquetas, plasma fresco congelado y crioprecipitados debería quedar determinado por la evaluación clínica del estado hemostático del paciente además de por recuentos frecuentes en sangre total y pruebas de coagulación. Estas pruebas ayudarán a determinar la necesidad de productos sanguíneos y la respuesta a los mismos.

Errores potenciales Los errores que conducen a la transfusión de componentes incorrectos de la sangre son más probables fuera de los horarios habituales de los laboratorios; por ello se ha recomendado que sólo deberían hacerse fuera de horas las transfusiones auténticamente de emergencia1,2.

SEROLOGÍA PRENATAL Y ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO La determinación del grupo ABO y D materno y la detección de anticuerpos antieritrocitarios deben hacerse de manera rutinaria en las primeras etapas del embarazo. Ésta es la base para la prevención, detección y, con la titulación o cuantificación del anticuerpo, el manejo de la enfermedad hemolítica del recién nacido.

Enfermedad hemolítica del recién nacido La enfermedad hemolítica del recién nacido es una anemia hemolítica del feto y el recién nacido que ocurre cuando aloanticuerpos maternos frente a antígenos fetales cruzan la placenta y causan hemólisis de los eritrocitos fetales o supresión de los progenitores de los eritrocitos fetales; esto último ocurre con anticuerpos frente al sistema Kell47. Como la IgG es la única inmunoglobulina que cruza la placenta, sólo los anticuerpos antieritrocitarios de esta clase son una causa potencial de enfermedad hemolítica del recién nacido. Los anti-D causan la forma más grave de enfermedad hemolítica del recién nacido, pero el éxito de la profilaxis posnatal con inmunoglobulinas anti-D ha reducido el número de casos y la rutinaria profilaxis anti-D prenatal lo reducirá incluso más. La proporción relativa de los otros anticuerpos IgG frente a los eritrocitos se ha incrementado. Aunque la enfermedad hemolítica del recién nacido causada por los anti-D es la forma más grave de la enfermedad, los anti-c pueden ocasionar una significativa hemólisis intrauterina, suficiente para causar muerte intrauterina y para justificar su detección en el embarazo. Los anti-K tienen un modo diferente de acción47, pero también pueden conducir a una grave afectación del feto. Otros anticuerpos IgG (p. ej., anti-E, anti-Ce, anti-Fya y anti–Jka), aunque de manera poco frecuente, ocasionan

una hemólisis fetal de suficiente gravedad para merecer intervención prenatal. La enfermedad hemolítica del recién nacido debida a anticuerpos ABO también es posible y se describe más adelante. Para una discusión detallada de la investigación y tratamiento de la enfermedad hemolítica del recién nacido, se remite al lector a las revisiones de Bowman48 y al libro de Mollison y cols.26.

Serología prenatal Determinación de los grupos ABO y D y detección de anticuerpos La determinación de los grupos ABO y D maternos, así como la detección de anticuerpos, se realizan de manera precoz en el embarazo (p. ej., en la primera visita) y a la semana 28 de gestación. A todas las mujeres embarazadas, tanto D positivas como negativas, se les debe realizar una detección de anticuerpos antieritrocitarios49,50. Las pruebas adicionales dependen de la especificidad de cualquiera de los anticuerpos detectados, de si son capaces de causar enfermedad hemolítica del recién nacido y de la historia obstétrica.

Seguimiento de la detección de anticuerpos Los protocolos para la detección prenatal y el seguimiento varían entre países. En el Reino Unido, el seguimiento es el recomendado por el BCSH49,50: 1. Todas las mujeres embarazadas tienen programada una determinación de ABO y D y una detección de anticuerpos en la primera visita y en la semana 28 de gestación. Si la detección de anticuerpos es negativa en la semana 28, no se requiere la repetición de las pruebas en la semana 36. 2. La mujeres embarazadas con anti-D, anticuerpos frente a antígenos relacionados con el Kell y anti-c deberían ser evaluadas mensualmente hasta la semana 28 y después cada 2 semanas hasta el parto. En estas mujeres debería titularse o cuantificarse el anticuerpo y se deberían buscar anticuerpos antieritrocitarios adicionales. 3. En mujeres embarazadas con otros anticuerpos antieritrocitarios, se realizará la titulación del anticuerpo en la primera visita y de nuevo en la semana 28. 4. Todas las mujeres embarazadas con historia previa de enfermedad hemolítica del recién nacido o aquellas con un incremento significativo de anti-D, anticuerpos frente a antígenos relacionados con el Kell o anti-c, deberían ser remitidas a una unidad especializada para valoración adicional de la necesidad de intervenciones prenatales. 5. Las mujeres embarazadas que tienen anticuerpos antieritrocitarios de otras especificidades, capaces de ocasionar una enfermedad hemolítica del recién nacido y que muestran un incremento significativo en el título de los mismos durante el embarazo, deberían tener su caso hablado con su obstetra. Ahora se sabe que el incremento en la titulación es más predictivo de afección fetal que el nivel concreto de anticuerpo51.

20 Aspectos de laboratorio de las transfusiones sanguíneas

Predicción del grupo sanguíneo fetal Pruebas a la pareja El fenotipo del grupo sanguíneo paterno debería determinarse en todos los casos en que la madre tenga un aloanticuerpo clínicamente significativo. Si los eritrocitos paternos carecen del correspondiente antígeno, el recién nacido no está en riesgo. Sin embargo, se aconseja tener precaución, porque el padre asumido podría no ser el padre biológico del feto. Es útil predecir si la pareja de una mujer que es D negativo y que tiene anti-D es homocigota o heterocigota para el antígeno D. Esto ayuda a pronosticar las probabilidades de tener niños afectados por la enfermedad hemolítica del recién nacido anti-D. No se dispone de antisueros contra el antígeno «d» porque el alelo «d» no existe. Debido a la falta de anti-«d» sérico, la cigosidad del antígeno se suele predecir por el resultado de las pruebas con anti-c, anti-C, anti-e y anti-E, y a partir de la probabilidad de asociación de los homocigotos o heterocigotos con estos antígenos (v. tablas 20.3 y 20.6). Estos datos han sido recopilados para distintos grupos raciales. Es importante, por ello, indicar al especialista del laboratorio el origen racial del paciente. Dado que actualmente se conoce la base genética para los tipos D habituales, la codificación del ADN proporciona una mejor alternativa para predecir el riesgo de enfermedad hemolítica del recién nacido52.

Muestras de sangre fetal Es posible tomar una muestra de sangre fetal, guiada con ecografía, para la determinación del grupo sanguíneo, pero ello conlleva algunos riesgos. La contaminación por sangre materna puede entorpecer el análisis de la muestra obtenida, conduciendo a un resultado falso negativo. Además, el procedimiento en sí puede conducir a hemorragia maternofetal y, por lo tanto, a mayor sensibilización a los antígenos fetales. Existe también riesgo de aborto53.

Análisis de ADN fetal en la circulación materna Actualmente es posible detectar ADN fetal en la circulación materna y obtener los grupos D y K de estas células, empleando técnicas de amplificación del ADN (v. cap. 21). Se ha demostrado que esta estrategia es precisa para predecir con precisión el grupo D, y en el Reino Unido actualmente se ofrece como un servicio clínico al comienzo del segundo trimestre54. Esta técnica podría reemplazar a pruebas más invasivas y complementar la determinación del grupo en la pareja. Esto es especialmente útil cuando la pareja está ausente o es desconocida.

Valoración prenatal de la gravedad de la enfermedad hemolítica del recién nacido En los últimos años se ha producido un considerable cambio en la valoración prenatal de la gravedad de la enfer-

Tabla 20.6. Fenotipos Rh más frecuentes con posibles genotipos y frecuencias en una población inglesa (explicando >99% de todos los genotipos Rh en esta población)53

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Reacción con antiD C c E

e

Fenotipo/genotipo más probable

Posibles genotipos 1

Frecuencia

+

+

+

–

+

DCe/dce R1r

DCe/dce R r DCe/Dce R1R0 Dce/dCe R0r’

32,68 2,16 0,05

+

+

–

–

+

DCe/DCe R1R1

DCe/DCe R1R1 DCe/dCe R1r’

17,68 0,82

–

–

+

–

+

dce/dce rr

dce/dce rr

15,10

–

+

+

–

+

Cde/cde r’r

Cde/cde r’r

0,76

-

–

+

+

+

cdE/cde r’’r

cdE/cde r’’r

0,92

+

+

+

+

+

DCe/DcE R1R2

DCe/DcE R1R2 DCe/dcE R1r’’ DcE/dCe R2r’ DCE/cde Rzr Dce /DCE R0Rz Dce/dCE R0Ry

11,87 1,00 0,28 0,19 0,01 70

Aproximadamente 30

Mujeres 17–50

12

51–60

19

61–70

20

>70

Aproximadamente 35

Embarazo Primera mitad

48 (62 sí anémica)

Segunda mitad

70 (95 sí anémica)

22 Miscelánea

quetarse (v. pág. 514), habitualmente a los 18-24 min. De la velocidad a la que ha tenido lugar la sedimentación durante este período de tiempo se obtiene la que tendría lugar a 60 min y se es convertida a un equivalente de VSG convencional mediante un algoritmo6.

Tubo inclinado Los eritrocitos sedimentan más rápidamente cuando corren por la pared de un tubo inclinado. Este fenómeno se ha incorporado en sistemas automatizados en los que el criterio de evaluación se lee tras 20 min con el tubo inclinado con un ángulo de 18 grados con respecto a la vertical. Esto ha demostrado proporcionar resultados comparables a los del método convencional7.

Anticoagulante La sangre en EDTA puede utilizarse sin diluirse en citrato, al menos si el hematocrito (Hto) está por debajo de 0,36 (hemoglobina 1 × 109/l) en un paciente anciano sugiere una leucemia mielomonocítica crónica o, algunas veces, una leucemia mieloide crónica atípica. Debido a que estas enfermedades entran en el grupo de trastornos mieloproliferativos/mielodisplásicos, el diagnóstico se vería apoyado por el hallazgo de esplenomegalia, alteraciones cuantitativas y cualitativas en otras líneas celulares y una alteración citogenética clonal.

Eosinofilia Leucocitosis Neutrofilia Los neutrófilos frecuentemente aumentan en número durante el embarazo y en infecciones agudas, inflamaciones, intoxicaciones y tratamiento corticosteroide, así como en la pérdida aguda de sangre o en caso de destrucción celular. La neutrofilia con neutrófilos que muestran una granulación citoplasmática densa (granulación «tóxica») es un hallazgo común en las infecciones bacterianas graves. En ausencia de una causa subyacente, un recuento de neutrófilos elevado con células mieloides inmaduras sugiere una leucemia granulocítica crónica. En este caso están indicados los estudios citogenéticos y moleculares en busca de t(9;22) y del gen de fusión BCR-ABL (v. cap. 21).

Linfocitosis La linfocitosis es característica de ciertas infecciones, especialmente de las infecciones en niños. Puede ser especialmente marcada en la tosferina, la mononucleosis infecciosa, la infección por citomegalovirus, la hepatitis infecciosa, la tuberculosis y la brucelosis. La linfocitosis es también una reacción transitoria frecuente tras el estrés físico grave. Los pacientes ancianos con trastornos linfoproliferativos, incluyendo la leucemia linfocítica crónica y los linfomas, frecuentemente se presentan con linfadenopatía y linfocito-

La eosinofilia se asocia típicamente con trastornos alérgicos incluidos los fenómenos de hipersensibilidad farmacológica, las enfermedades cutáneas y las infecciones parasitarias. En la mayoría de los casos, la causa viene dada por la historia clínica, que debe incluir los detalles de todas las medicaciones y viajes al extranjero, y por la exploración de la orina y las heces en busca de parásitos o huevos. Se emite un diagnóstico de leucemia eosinofílica crónica si existe un incremento de blastos en la sangre o en médula o si hay una evidencia citogenética o molecular de un clon mieloide anormal. El síndrome hipereosinofílico idiopático es un caso poco habitual de eosinofilia en el que la liberación del contenido de los gránulos eosinofílicos produce daños en el corazón, los pulmones y otros tejidos. Éste es un diagnóstico de exclusión, sólo realizado cuando mediante una investigación detallada se han excluido todas las causas conocidas. Es necesario excluir de forma específica la leucemia eosinofílica y la eosinofilia inducida por citocinas resultante de la presencia de un clon neoplásico de células T antes de diagnosticar una enfermedad como síndrome hipereosinofílico idiopático.

Basofilia La basofilia como hallazgo aislado es infrecuente. Sin embargo, es un dato frecuente en los trastornos mieloprolife-

23 Aproximación al diagnóstico y clasificación de los trastornos hematológicos

rativos, y los basófilos pueden ser especialmente prominentes en la leucemia granulocítica crónica. En esta enfermedad, un recuento de basófilos creciente puede ser la primera indicación de una transformación a un curso más agresivo.

Trombocitosis La trombocitosis suele asociarse a enfermedades infecciosas e inflamatorias como la osteomielitis y la artritis reumatoide. Las causas hematológicas de trombocitosis incluyen pérdidas sanguíneas crónicas, destrucción de eritrocitos, esplenectomía y rebote tras recuperación de una supresión de médula ósea. Bajo estas circunstancias, un incremento moderado en el recuento plaquetario (p. ej., 400-800 × 109/l) habitualmente no conlleva consecuencias patológicas. La trombocitemia primaria (esencial) pertenece al espectro de trastornos mieloproliferativos y se caracteriza por un recuento plaquetario elevado persistente (con frecuencia se define de forma arbitraria como superior a 600 × 109/l) y complicaciones trombóticas o hemorrágicas. Posteriores investigaciones para confirmar la trombocitemia primaria incluyen la exploración de la médula ósea en busca de un incremento del número de megacariocitos o de la existencia de megacariocitos anormales, así como los análisis citogenéticos.

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2. Reducción del número de células Reducciones en más de una línea celular La reducción del número de células tiene lugar por un incremento en la destrucción, una reducción de la producción o un incremento de su retención en el bazo u otros órganos. La reducción en la producción de células puede ser resultado de una anemia aplásica, carencia de nutrientes hematínicos como ácido fólico o vitamina B12 o interferencia con la hematopoyesis normal por infiltración (p. ej., leucemia; linfoma; mieloma múltiple; carcinoma metastático, frecuentemente con mielofibrosis secundaria; etc.), infección (p. ej., infección por virus de la inmunodeficiencia humana [VIH], tuberculosis, leishmaniasis, etc.) o exposición a toxinas (p. ej., alcohol) o fármacos mielosupresores (p. ej., hidroxicarbamidaa o busulfán). Ciertas neoplasias mieloides (p. ej., mielofibrosis «idiopática») y los síndromes mielodisplásicos (SMD) se caracterizan por citopenia, y ésta es también algunas veces una característica de la leucemia mieloide aguda (LMA). Una causa relativamente frecuente de reducción global en las células circulantes es el secuestro de células en un bazo marcadamente grande (hiperesplenismo), lo que puede ser secundario a síndromes como la mielofibrosis y la hipertensión portal. El examen de un aspirado de médula ósea y de un espécimen de biopsia por trepanación suele ser útil para determinar la causa de una bicitopenia o de una pancitopenia para las que no se ha hallado una causa obvia.

a

Previamente conocida como hidroxiurea.

Anemia Hay muchas causas de anemia, y una clasificación lógica sería aquella basada en el mecanismo de su producción: 1. 2. 3. 4.

Producción de eritrocitos disminuida. Acortamiento de la vida de los eritrocitos. Pérdida de sangre. Secuestro esplénico.

En la práctica, si la causa no es inmediatamente aparente a partir de las circunstancias clínicas pero se dispone de un analizador automático de recuento sanguíneo, la clasificación de acuerdo con el tamaño celular es más práctica. La selección de exploraciones que se llevarán a cabo a continuación viene determinada por el volumen corpuscular medio (VCM) y por la morfología eritrocitaria, además de por las características clínicas del proceso. La anemia por tanto puede dividirse a grandes rasgos en tres tipos: 1. Microcítica (VCM bajo). 2. Macrocítica (VCM alto). 3. Normocítica (VCM normal). Un VCM bajo puede asociarse con una baja hemoglobina corpuscular media (HCM). Menos frecuente es hallar una baja concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), lo que se correlaciona con hipocromía. Las figuras 23.1 a 23.3 son algoritmos que proporcionan una secuencia ordenada de pruebas que se deben realizar para los diferentes tipos de anemia sobre la base de estos índices. La exploración de una extensión sanguínea habitualmente sugerirá la vía más rápida para el diagnóstico; la confirmación puede requerir pruebas más específicas, que se plantean en el texto. La presencia de punteado basófilo en un paciente con eritrocitos microcíticos sugiere rasgo talasémico o envenenamiento por plomo. Un aspecto dimórfico en la extensión sanguínea es típico de una anemia sideroblástica congénita pero más frecuentemente es el resultado de una deficiencia de hierro que está respondiendo al tratamiento. Los cuerpos de Pappenheimer sugieren que una anemia microcítica es resultado de una eritropoyesis sideroblástica.

Anemia microcítica (v. fig. 23.1) La causa más frecuente de anemia en todo el mundo es el déficit de hierro. Puede sospecharse esta causa a partir de un VCM bajo y de la presencia de eritrocitos microcíticos e hipocrómicos. La confirmación de laboratorio del déficit de hierro puede incluir mediciones de ferritina sérica y de hierro sérico, junto con bien la capacidad de unión de hierro, bien la determinación de transferrina, protoporfirina eritrocitaria y tinción de aspirados de médula ósea para hierro (v. cap. 4). Un diagnóstico de déficit de hierro requiere buscar la causa del mismo. Esta búsqueda debe incluir preguntas explícitas acerca de pérdidas sanguíneas e insuficiente ingesta en la dieta y puede requerir la exploración de las heces en busca de parásitos y sangre oculta, la exploración endoscópica del tracto gastrointestinal para excluir enfer-

523

524

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

VCM/HCM bajo

Extensión sanguínea (punteado basófilo y ferritina sérica)*

Ferritina baja

Ferritina normal, RE alto, Hb normal o casi normal

Ferritina normal o alta, RE y Hb reducidas

Déficit de hierro

HbEP o HPLC/Hb A2

Evaluar datos clínicos ± hierro en médula ósea

Rasgo talasémico o variante de hemoglobina

Anemia de enfermedades crónicas

* Considerar envenenamiento por plomo

Figura 23.1. Investigación de una anemia microcítica hipocrómica. HbEP, electroforesis Hb; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; RE: recuento eritrocitario.

medades malignas ocultas y pruebas serológicas o de otro tipo para enfermedad celíaca. El diagnóstico diferencial de anemia ferropénica incluye la anemia por enfermedad crónica. Las características clínicas y de laboratorio propias de inflamación pueden sugerir este diagnóstico, que se confirma por la demostración de ferritina sérica normal o alta, bajo hierro sérico y bajas transferrina y capacidad de fijación de hierro. Las talasemias también causan microcitosis, pero tanto la talasemia α como la talasemia β se suelen asociar con un incremento en el recuento eritrocitario y una Hb normal o casi normal a pesar de la considerable reducción del VCM o de la HCM, mientras que en el déficit de hierro el VCM y la HCM no disminuyen hasta que la Hb se encuentra significativamente reducida. Investigaciones más complejas, como la electroforesis de hemoglobina, la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o la determinación de Hb A2 y Hb F suelen confirmar el diagnóstico de rasgo talasémico β. El diagnóstico de rasgo talasémico α es más difícil; la detección de las infrecuentes inclusiones HbH suele ser posible en el rasgo talasémico α, pero el diagnóstico definitivo requiere un análisis de ADN. El diagnóstico de rasgo talasémico α+ tiene menos importancia clínica; las inclusiones HbH pueden no detectarse y, por tanto, es preciso proceder al análisis de ADN.

también asociarse al consumo excesivo de alcohol y a la enfermedad hepática o a fármacos como la hidroxicarbamida o la zidovudina. La macrocitosis resultante de la hemólisis crónica se asocia con incrementos en los números de eritrocitos inmaduros, que parecen ligeramente más grandes y más azules que los eritrocitos normales en una

VCM/HCM bajo

Extensión sanguínea, B12 sérica, folato eritrocitario o sérico, recuento de reticulocitos, historia de fármacos (hidroxicarbamida, zidovudina, etc.), historia de abuso del alcohol, pruebas de función hepática, pruebas de función tiroidea

Diagnóstico claro (SMD, déficit de vitamina B12 o ácido fólico, efecto de fármacos o alcohol, enfermedad hepática, hipotiroidismo)

Diagnóstico no claro

Recuento reticulocitario bajo

Recuento reticulocitario alto

Aspirado de médula ósea

Pérdida de sangre aguda o anemia hemolítica

Anemias macrocíticas (v. fig. 23.2) Un VCM alto con macrocitos ovales y neutrófilos hipersegmentados sugiere deficiencia de ácido fólico o vitamina B12 y es una indicación de que debe realizarse una cuantificación de estas vitaminas (v. cap. 8); investigaciones ulteriores podrían incluir estudios de malabsorción, pruebas serológicas para enfermedad celíaca o bien pruebas para detectar anticuerpos antifactor intrínseco o un prueba de Schilling para detectar una anemia perniciosa (v. pág. 155). Si se detectan anticuerpos contra el factor intrínseco, no es necesario realizar una prueba de Schilling. Un VCM alto puede

SMD, estado de déficit con pruebas normales, anemia aplásica

Figura 23.2. Investigación de una anemia macrocítica. SMD: síndrome mielodisplásico.

23 Aproximación al diagnóstico y clasificación de los trastornos hematológicos

extensión de sangre periférica con tinción de Romanowsky. Para confirmar la reticulocitosis pueden utilizarse la tinción supravital de extensiones sanguíneas (v. págs. 35-36) o un recuento reticulocitario automatizado. La anemia no tratada asociada con policromasia es probable que indique pérdida de sangre o hemólisis. La combinación de fragmentos eritrocitarios, trombocitopenia y policromasia indica una anemia hemolítica microangiopática y debe impulsar la realización de nuevas pruebas diagnósticas como recuento plaquetario, estudios de coagulación, evaluación de la función renal y una búsqueda de infección o enfermedad neoplásica. Estas nuevas evaluaciones son urgentes porque los datos anteriores pueden estar indicando la existencia de una púrpura trombótica trombocitopénica, que requiere tratamiento rápido mediante plasmaféresis.

Anemia normocítica (v. fig. 23.3) La anemia normocítica normocrómica suele ser el resultado de una enfermedad crónica subyacente, no hematológica. Las pruebas deben dirigirse a explorar la existencia de insuficiencia renal, infecciones subclínicas, enfermedades autoinmunes y neoplasias. En presencia de anemia, la ausencia de policromasia, unida a reticulocitopenia, apunta a un fallo primario de la eritropoyesis o a la existencia de pérdidas sanguíneas o hemólisis sin producción eritrocitaria compensatoria. El examen de la médula ósea puede ser

útil para demostrar las causas hematológicas de una anemia normocítica normocrómica como una anemia aplásica o un síndrome mielodisplásico precoz. La tinción de hierro puede también ser útil para demostrar la existencia de un bloqueo en el metabolismo del hierro, lo que sugiere una anemia asociada a enfermedad inflamatoria crónica.

Leucopenia Neutropenia Una vez que se ha excluido una variación fisiológica, la etnia o una neutropenia familiar o cíclica (v. págs. 18-19), las causas no hematológicas de neutropenia aislada que deben considerarse incluyen la infección no controlada, los trastornos autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico, la irradiación, los fármacos (en especial, los agentes anticancerosos) y la leucemia de linfocitos grandes granulares. El examen de médula ósea puede ayudar a determinar si el problema es el resultado de la destrucción periférica (precursores mieloides en médula aumentados) o de un fracaso en las células madre (ausencia de precursores mieloides en la médula ósea). En la neutropenia inducida por fármacos el aspecto de la médula ósea es muy característico ya que existe una relativa escasez de neutrófilos maduros, como lo es también en el síndrome de Kostmann (agranulocitosis genética infantil), en el que existe una interrupción de la maduración en el estadio promielocítico.

VCM normal/ HCM normal

Extensión sanguínea

Recuento reticulocitario

Reticulocitos normales/bajos

Reticulocitos altos

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Morfología de la médula ósea

Anormal

Normal

Anemia secundaria (p. ej., inflamación, enfermedad renal, hepática o deficiencia endocrinológica)

Figura 23.3.

Hipoplásica

Infiltración/fibrosis

Diseritropoyética

Anemia aplásica

Leucemia, mielomatosis, metástasis, mielofibrosis

Mielodisplasia

Investigación de una anemia normocítica normocrómica.

Pérdidas sanguíneas agudas

Hemólisis

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Número reducido de linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos El número de linfocitos, eosinófilos y basófilos puede verse conjuntamente reducido por agresiones como la cirugía, los traumatismos y la infección. La combinación de linfopenia y neutrofilia es frecuente en las alteraciones hematológicas que acompañan al síndrome respiratorio agudo grave. La linfopenia, especialmente a expensas de células CD4, puede aparecer en la infección por VIH y el fracaso renal. La monocitopenia ( Hematology.

En Europa, los dispositivos de diagnóstico médico in vitro (IVDMD, del inglés in vitro diagnostic medical devices) utilizados en el laboratorio, que incluyen instrumentos y equipos, reactivos, calibradores y materiales de prueba, se controlan mediante una directiva del Consejo y del Parlamento Europeo. Se requiere que los fabricantes usen la marca de la CE en sus productos para certificar que cumplen las prestaciones que anuncian1. Los detalles de la directiva se encuentran en la página web de la MDA (v. tabla 24.6). Una serie de compañías también ofrecen información útil (p. ej., www.ce-marking.org). El proceso está supervisado a nivel nacional por las autoridades competentes (p. ej., en el Reino Unido por la Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency [MHRA], antes la Medical Devices Agency). Los esquemas de valoración externa de la calidad tienen su papel a la hora de identificar las prestaciones insatisfactorias de los dispositivos. Los siguientes estándares ISO (y CEN) tienen que ver con la práctica de laboratorio y los requisitos de la directiva IVDMD; su conformidad puede ser también obligatoria en los países de fuera de Europa: 1. Series ISO 9000 y 10000. Un grupo de estándares que especifican diversos aspectos de los sistemas de gestión de la calidad de cualquier organización. 2. EN ISO 15189. Requerimientos particulares de los laboratorios médicos de calidad y aptitud. Tiene en cuenta los requerimientos de la serie ISO 9000 cuando son relevantes para la práctica médica del laboratorio; también incluye un documento suplementario acerca de las pruebas en el punto de asistencia (ISO 22870). 3. ISO 22869. Guía de la puesta en marcha de la ISO 15189 en el laboratorio. 4. EN ISO 17511. IVDMD-trazabilidad métrica de los valores asignados a los calibradores y a los materiales de control. 5. ISO 15198. IVDMD-validación de los procedimientos del control de calidad de los usuarios por el fabricante. 6. EN 14136. Utilización de esquemas externos de valoración de la calidad en la evaluación de las prestaciones de los procedimientos de examen del diagnóstico in vitro. 7. Guía ISO 43. Pruebas de control por medio de comparaciones interlaboratorios. a) Parte 1. Desarrollo y operativa de los esquemas de las pruebas de aptitud técnica. b) Parte 2. Selección y uso de los esquemas de las pruebas de aptitud por organismos de acreditación de laboratorios. El uso de preparaciones de referencia y los principios de garantía de la calidad se describen en este capítulo. El recuento sanguíneo se usa como modelo ilustrativo. Los es-

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tándares disponibles para otras pruebas se mencionan en las secciones de este libro donde están descritas.

PREPARACIONES DE REFERENCIA

Hemoglobina La disponibilidad de una preparación de referencia internacional de cianmetahemoglobina (HiCN) ha contribuido a mejorar la exactitud de la medición de la hemoglobina2. En algunos países, las preparaciones que cumplen con el estándar internacional son certificadas por las autoridades nacionales apropiadas. Se puede obtener una cantidad limitada de estándar internacional de la OMS, y el IRMM ofrece un material de referencia certificado comparable (v. pág. 591). Una característica importante de este material es que es estable durante al menos varios años. En los lugares donde está prohibido el uso del reactivo cianuro para la hemoglobinometría sistemática, se puede emplear aún la cianmetahemoglobina estándar para asignar un valor de hemoglobina a las preparaciones de sangre total o lisada (v. pág. 564), el cual se usa entonces como estándar secundario local tras una dilución apropiada. La parte lisada no diluida es estable hasta 6 meses, y la sangre completa es estable durante 3 semanas aproximadamente, pero tras la dilución apenas dura unos días. Tanto la sangre total como la lisada son útiles para la garantía de calidad de la hemoglobinometría; las muestras de referencia de sangre total se deben introducir en lotes de muestras sanguíneas, y todas las muestras se deben analizar juntas. Esto es aplicable tanto al método automático como al manual.

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Células sanguíneas Las preparaciones estándar son esenciales para la calibración de los contadores electrónicos de partículas, especialmente los sistemas automáticos que se pueden ajustar arbitrariamente. Esto significa que para obtener un resultado verdadero, el aparato debe calibrarse utilizando una preparación de referencia con valores asignados de una exactitud conocida. La sangre natural, extraída en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), no tiene valor como preparación de referencia debido a su corta vida en el laboratorio. Se ha intentado preservar la sangre por varios métodos sin que se afectaran los componentes del recuento sanguíneo3,4, y se dispone de productos comerciales con sangre preservada, pero son específicos de cada equipo. La sangre se mantiene durante algunas semanas a 4 °C si se le añade ácido-citrato-dextrosa (ACD) o citrato-fosfato-dextrosa (CPD). Incluso así, el volumen corpuscular medio (VCM) disminuye ligeramente y alguno eritrocitos se lisan, de manera que no se puede utilizar la sangre como material de referencia, aunque se puede utilizar como preparación de control para comprobar la precisión y el funcionamiento fiable de un sistema de recuento celular en períodos relativamente cortos3. Se han hecho intentos para ofrecer partículas de tamaño adecuado en suspensiones estables como sustitutos de las

células sanguíneas normales. Entre ellas están los eritrocitos fijados y las partículas esféricas de látex5. Las células se pueden estabilizar permanentemente por medio de la fijación (p. ej., en una solución de glutaraldehído). El glutaraldehído origina que los eritrocitos encojan de tamaño inmediatamente, y este proceso de encogimiento continúa durante 3-4 días. Después de eso, las células permanecen constantes en tamaño y forma, y el resultado del recuento celular y la distribución del tamaño celular permanecen iguales durante meses e incluso años. Por tanto, estas células fijadas se pueden usar para medir la precisión de la función de un equipo, pero debido a que se trata de discos bicóncavos e inflexibles con propiedades de flujo que difieren de las de la sangre fresca en los sistemas de análisis, no se pueden utilizar para calibrar un instrumento que analice sangre natural6,7. Para el recuento total de leucocitos se han utilizado con éxito dos tipos de material como materiales estándares de referencia, al menos con analizadores simples, pero es posible que estas preparaciones fijadas no sean apropiadas para su utilización con algunos sistemas modernos. 1. Leucocitos concentrados de sangre humana y fijados en la siguiente solución8: ácido acético glacial, 42 mg; sulfato de sodio, 7 g; cloruro sódico 7 g; y agua, hasta 1 l. 2. Eritrocitos fijados con glutaraldehído suspendidos en sangre total de mamífero libre de leucocitos9. La sangre de pollo o de pavoa, cuyos eritrocitos son nucleados, es apropiada para el recuento de leucocitos totales. Diferentes especies animales pueden proporcionar células de tamaños comparables a las del recuento diferencial de leucocitos; sin embargo, otras propiedades físicas de los diferentes tipos de leucocitos no tienen un paralelismo con los materiales de referencia, de manera que dichas preparaciones no son apropiadas como estándares directos para recuentos diferenciales automatizados, basados en la identificación de las células por sus diversas propiedades físicas.

Asignación de valores Los métodos utilizados para la asignación de valores a los materiales de referencia deben ser tan válidos y precisos como prácticos. Se han descrito métodos estandarizados de referencia para la concentración de hemoglobina (Hb), el recuento de eritrocitos (RE), el recuento de leucocitos (RL) y el hematocrito (Hto) (v. cap. 3).

MATERIALES PARA EL CONTROL DE CALIDAD Se dispone de productos comerciales, y también se pueden hacer los controles a nivel local, aunque puede haber ciertas dificultades técnicas a la hora de preparar dichos materiales «domésticos». Por ejemplo, el plasma almacenado puede volverse turbio, los análisis serológicos o químicos a Disponible comercialmente (p. ej., TCS Biosciences Ltd., Buckingham MK18 2LR, Reino Unido).

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

pueden verse afectados por la inestabilidad de las enzimas, y las reacciones inmunológicas se pueden alterar por la adición de conservantes. El recuento de sangre entraña problemas especialmente difíciles debido a la necesidad de asegurar la homogeneidad entre las muestras de partes alícuotas y la inestabilidad de las células sanguíneas, ya que los procesos que potencian la estabilidad de las muestras de sangre distorsionan el comportamiento de las células, de manera que el material control no es estrictamente análogo a la sangre fresca. No obstante, teniendo en cuenta estas dificultades, la sangre preservada o estabilizada proporciona un material apropiado para los procedimientos internos de control de calidad para la hemoglobina y el recuento de eritrocitos y leucocitos. Resulta apropiada la sangre mantenida en ACD o CPD (v. pág. 587) y pasada a través de un dispositivo de perfusión sanguínea para eliminar cualquier coágulo. Para los lisados también resulta apropiada la sangre en EDTA o heparina. Hay que tener cuidado en todas las etapas para evitar la contaminación. Siempre que sea posible, se deben utilizar materiales de vidrio y reactivos estériles, y adoptar procedimientos asépticos de manejo. Para ayudar a mantener la esterilidad, hay que añadir al producto antibióticos de amplio espectro (p. ej., 1 mg de penicilina junto con 5 mg de gentamicina por cada 100 ml). Cuando se usa sangre humana, hay que tratarla de la misma forma que una muestra de un paciente y, si es posible, se debería revisar para confirmar que sea negativa para la hepatitis B y C y para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

Preparación de la sangre preservada La preparación de sangre preservada comprende los siguientes pasos9,10: 1. Extraer sangre en un recipiente estéril (p. ej., una bolsa de donante de sangre) con anticoagulante ACD o CPD (v. pág. 587). Dejarlo durante 2-3 días a 4 °C. 2. Centrifugar la sangre durante 20 min a aproximadamente 2.000 g. Separar (y guardar) el plasma sobrenadante pero descartar la capa leucocitaria. Transferir el concentrado de eritrocitos a frascos de 500 ml. 3. Mezclar 3 volúmenes de eritrocitos con 1,5 volúmenes de NaCl, 9 g/l, centrifugar la sangre durante 20 min a aproximadamente 2.000 g y retirar el sobrenadante y la capa superior de eritrocitos por aspiración. 4. Repetir el paso 3. 5. Diluir 5 volúmenes del plasma en 2 volúmenes de NaCl, 9 g/l y añadir antibiótico. 6. Añadir el plasma diluido del paso 5 al concentrado de eritrocitos en una ratio apropiada, para obtener una prepab Se recomienda una unidad para dispensar la mezcla como la descrita por Ward y cols.11, para un reparto a gran escala (p. ej., para muestras NEQAS, v. pág. 569). Se puede construir utilizando utensilios de vidrio estándares, excepto por la cabeza especialmente diseñada del matraz. La información está disponible en el Department for Medical Engineering, Imperial College, Hammersmith Campus, Londres W12 0NN.

ración adecuada para utilizarla como control del recuento de eritrocitos. 7. Mezclar bien y, con mezclado continuo, depositar volúmenes de partes alícuotas en viales estériles limpiosb, y tapar bien. Mantener a 4 °C. Asignar valores para la Hb, el RE y el Hto mediante al menos 5 mediciones repetidas, utilizando el contador con el que se llevarán a cabo las pruebas subsiguientes. Antes del análisis, mezclar la muestra en un mezclador de rodillos o a mano, continuamente, durante 5 min antes de abrirlo. El coeficiente de variación (CV) entre las pruebas no debe exceder el 2%. Comprobar la homogeneidad del reparto entre las pruebas mediante recuentos repetidos en 5 viales seleccionados al azar. Se pueden mantener los viales de sangre humana sin abrir en buenas condiciones durante unas 3 semanas a 4 °C, y la sangre de equino se puede mantener hasta 2 meses10. La sangre equina tiene una ventaja añadida, y es que se puede utilizar para simular sangre microcítica humana, ya que los eritrocitos de caballo tienen un VCM de aproximadamente 50 fl.

Preparación del lisado 1. Extraer sangre como se describe previamente (p. ej., en una bolsa de donante de transfusión sanguínea). La sangre de donante caducada se puede utilizar siempre que no esté lisada. Centrifugar a aproximadamente 2.000 g durante 20 min y descartar el plasma y la capa leucocitaria. 2. Añadir un volumen igual de NaCl 9 g/l, mezclar bien, traspasar a un frasco estéril y volver a centrifugar; descartar el sobrenadante. Repetir tres veces el lavado en solución salina para asegurar una eliminación completa del plasma, los leucocitos y las plaquetas. 3. A cada volumen de 10 ml de células lavadas, añadir 6 volúmenes de agua y 4 volúmenes de tolueno, tapar y agitar vigorosamente con un agitador o vibrador mecánico durante 1 h. Dejarlo a continuación toda la noche a 4 °C, para permitir que los lípidos y los restos celulares formen una superficie semisólida entre el tolueno y el lisado. 4. Al día siguiente, centrifugar a aproximadamente 2.000 g durante 20 min, eliminar las capas de lisado y almacenarlas en un frasco limpio. 5. Utilizando una aspiración de vacío suave (p. ej., mediante una bomba de agua), filtrar el lisado a través de un papel de filtro grueso (p. ej., Whatman n.º 1) en un embudo Buchner. Repetir la filtración utilizando un filtro de microporos de 0,22 μm o un papel de filtro fino (p. ej., Whatman n.º 42), cambiando el papel siempre que la filtración disminuya. Es importante no sobrecargar el embudo con el lisado. 6. A cada 70 ml del lisado, añadir 30 ml de glicerol y de antibiótico de amplio espectro (v. pág. 588). Si se necesita una Hb inferior, añadir 30% de glicerol en solución salina. Mezclar bien, repartir en contenedores estériles y tapar bien. Asignar un valor para la Hb por el método espectrofotométrico (v. pág. 27); llevar a cabo 10 pruebas repetidas, co-

26 Control de calidad

giendo muestras al azar de diversos viales del lote. El CV debe ser menor del 2%. Almacenado a 4 °C, el producto debe mantener su valor asignado como mínimo varios meses, o durante 1-2 años si se mantiene a –20 °C.

Preparación del control de sangre total estabilizada12 Reactivos Formaldehído 37-40% Glutaraldehído 50% Citrato trisódico Agua

6,75 ml 0,75 ml 26 g hasta 100 ml

Método

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1. Obtener sangre total en CPD o ACD. Debe ser tan fresca como sea posible, y nunca con más de 3 días de antigüedad postextracción. Filtrar a través de un filtro de sangre de 40 μm en una serie de frascos de plástico. 2. Si se necesita un recuento elevado de eritrocitos, centrifugar la sangre y eliminar parte del plasma; si se necesita un recuento de eritrocitos menor, diluir la sangre en una cantidad apropiada de plasma. Si los frascos emparejados se centrifugan con cuidado (aproximadamente 1.500 g) durante 15 min para producir capas leucocitarias, éstas se pueden manipular de una manera similar para proporcionar diferentes niveles de recuentos de leucocitos y plaquetas. Añadir antibióticos de amplio espectro (v. pág. 563) a cada muestra. 3. Mezclar bien y añadir un volumen de reactivo a 50 volúmenes de suspensión celular. Mezclar con una batidora mecánica durante 1 h a temperatura ambiente y dejar durante 24 h a 4 °C. 4. Mezclando continuamente, repartir en contenedores estériles, tapar bien y sellar con una cinta de plástico. Refrigerar a 4 °C hasta que se utilicen. Los viales sin abrir se pueden mantener a 4 °C en buenas condiciones durante varios meses. Para analizarlas, las muestras deben mezclarse cuidadosamente con un mezclador de rodillos o a mano antes de abrirlas. Asignar valores a la hemoglobina y al recuento de células mediante al menos 5 pruebas por duplicado y comprobar la homogeneidad entre muestras con recuentos repetidos en 5 viales seleccionados al azar. El CV no debe exceder el 2%. Hay que saber, no obstante, que el Hto obtenido por centrifugación será aproximadamente un 10% mayor al obtenido por contadores automáticos.

Método simple para las preparaciones de control de calidad del recuento sanguíneo El método descrito a continuación proporciona una preparación adecuada para el control del recuento del total de eritrocitos, leucocitos y plaquetas para algunos contadores de células sanguíneas semiautomáticos, pero no es apropiado para algunos sistemas automáticos. Debe ser estable durante aproximadamente 3 semanas si se mantiene a 4 °C.

Método 1. Extraer una unidad de sangre humana en anticoagulante CPD (v. pág. 587). Llevar a cabo el siguiente procedimiento en el plazo de 1 día tras la extracción. 2. Filtrar la sangre a través de un conjunto de recipientes de transfusión sanguínea a un frasco de cristal de 500 ml. 3. Añadir 1 ml de formaldehído fresco al 40%. Mezclar bien dándole la vuelta y dejarlo después en un mezclador de rodillos durante 1 h. 4. Dejar a 4 °C durante 7 días, mezclándolo por inversión varias veces al día. Al final de este período de almacenamiento, mezclar bien en un mezclador de rodillos durante 20 min y después, mezclándolo constantemente a mano, depositarlo en volúmenes de 2 ml en contenedores estériles.

Preparación de sustitutos de leucocitos Los eritrocitos de pollo y pavo son nucleados y, cuando se fijan, su tamaño se encuentra dentro del rango de los leucocitos humanos reconocido por los contadores electrónicos de células. Son, por tanto, apropiados para servir como sucedáneos de leucocitos13. Sin embargo, dicho material puede no ser apropiado para los sistemas de recuento que se basan en tecnologías diferentes al cálculo del tamaño celular por impedancia. Para utilizar como control de leucocitos, deben bastar 25 ml de sangre extraída en cualquier anticoagulante; tras el procesado se añade una cantidad apropiada a la sangre total conservada. Se debe mantener la esterilidad a lo largo de todo el proceso.

Método 1. Centrifugar la sangre a aproximadamente 2.000 g durante 20 min y retirar el plasma de forma aséptica. 2. Añadir un volumen igual de tampón fosfato 0,15 mol/l, pH 7,4 (v. pág. 589); mezclar y transferir a un frasco estéril de centrífuga; volver a centrifugar y desechar el sobrenadante y la capa leucocitaria. 3. Repetir el lavado y la centrifugación dos veces. A las células lavadas, añadir 10 veces su volumen de fijador de glutaraldehído (0,25% en tampón fosfato 0,15 mol/l, pH 7,4). Dejarlo toda la noche a 4 °C. 4. Al día siguiente, agitar vigorosamente para asegurar la resuspensión completa. Mezclar en una batidora mecánica durante 1 h. Para comprobar que la fijación se ha completado, centrifugar 2-3 ml de la suspensión, desechar el sobrenadante y añadir agua al depósito. Si aparece lisis, hay que reemplazar el glutaraldehído de depósito. 5. Cuando la fijación se haya completado (es decir, tras 18 h de exposición), centrifugar la suspensión a aproximadamente 2.000 g durante 10 min y desechar el sobrenadante. Añadir un volumen igual de agua al depósito de células fijadas, volver a suspender y mezclar removiendo y agitando; centrifugar de nuevo a aproximadamente 2.000 g durante 10 min y desechar el sobrenadante; repetir dos veces. 6. Volver a suspender las células fijadas a aproximadamente una concentración del 30% en NaCl, 9 g/l. Mezclar bien

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

agitando vigorosamente. Añadir antibiótico (v. pág. 563), tapar bien, sellar con un precinto de plástico y almacenar a 4 °C. Antes de utilizarlo, dejar el vial a temperatura ambiente durante 10-20 min; volver a suspender agitando vigorosamente con la mano o en un mezclador de vórtice, hasta que no queden grumos en la base del contenedor, y mezclar después en un mezclador rotatorio durante al menos 20 min antes de abrir el vial. Para usar como sucedáneo de los leucocitos, tras la resuspensión tal y como se describe previamente, transferir una cantidad apropiada a un volumen de sangre conservada, cuyos leucocitos se hayan eliminado pasándola a través de un filtro de leucocitos. Establecer el recuento mediante 5-10 mediciones repetidas en 3 viales, y comprobar la homogeneidad entre las muestras con recuentos en 3 viales elegidos al azar del lote. El CV no debe ser mayor del 5%. A veces, aparecen lotes insatisfactorios que deben desecharse.

Preparación del control de calidad para el recuento plaquetario9 Reactivos Solución Alsever. (A) citrato trisódico, 16 g; NaCl, 8,2 g hasta 1 l con agua; (B) dextrosa, 41 g hasta 1 l con agua. Almacenar a 4 °C. Inmediatamente antes de usar, mezclar volúmenes iguales de A y B, y filtrar a través de un filtro de microporos de 0,2 μm. Solución EDTA. K2-EDTA 100 g/l en la solución Alsever; estable durante 6 meses a 4 °C.

Método 1. Extraer una unidad de sangre en anticoagulante ACD o CPD. Centrifugar durante 10 min a 200 g y recoger la suspensión plaquetaria en un contenedor de plástico. 2. Añadir 1 ml de la solución de EDTA. Mezclar bien y dejar a 37 °C durante 2 h, para dejar que las plaquetas se desagreguen. 3. Añadir 200 ml de glutaraldehído fijador (0,25% en tampón fosfato 0,15 mol/l, pH 7,4). Agitar vigorosamente con la mano para asegurar una distribución completa de las plaquetas, y dejarlo durante 48 h a temperatura ambiente, agitándolo ocasionalmente. 4. Centrifugar durante 30 min a 3.500 g. Lavar el depósito dos veces en solución de Alsever y, por último, volver a suspender en 15-20 ml de la solución de Alsever. 5. Realizar un recuento plaquetario grosero, para determinar la concentración aproximada, y añadir una cantidad apropiada de la suspensión a la sangre conservada (v. pág. 563). Mezclar bien durante 20 min y, mezclando continuamente, repartir en contenedores estériles. Tapar y sellar. A 4 °C, las preparaciones deben tener una vida media de 3-4 meses. Antes de usar, volver a suspenderlo agitando vigorosamente con la mano; a continuación, realizar una mezcla mecánica durante aproximadamente 15 min.

Se ha notificado un método más sencillo de preservar las plaquetas, mediante la adición de prostaglandina E1 a la sangre con ACD, que proporciona una preparación control con una estabilidad de unos 14 días14.

ANÁLISIS DE LOS DATOS

Desviación estándar de los controles Un material de control lo puede preparar un laboratorio concreto como se describe previamente, o bien puede obtenerse en el mercado. Para asegurar la homogeneidad, el producto se debe repartir en viales mezclándolo continuamente; esto se realiza de forma idónea por medio de un matraz rotatorio. Con este propósito, se ha diseñado específicamente una unidad de mezcla (v. pie de página, pág. 564). La homogeneidad intertubos se debe comprobar midiendo los analitos relevantes en al menos 3 viales (aunque preferiblemente en 10), tomados al azar del lote. Sus resultados deben encontrarse dentro de 2 desviaciones estándar (DE) de 5-10 medidas repetidas de una muestra del lote. La DE se calcula como se muestra en la página 594. El cálculo del CV proporciona una forma alternativa de expresar la dispersión de los resultados. La ventaja del CV es que describe la importancia de la DE con independencia del valor medido.

Gráficos de control El uso de gráficos de control fue aplicado por primera vez en química clínica por Levey y Jennings15. Se utilizan ahora extensamente en hematología tanto para procedimientos automáticos como manuales. Muestras de la muestra de control se incluyen en cada batería de las muestras del paciente, y los resultados se comprueban en un gráfico de control. Para verificar la precisión no es necesario conocer el valor exacto de la muestra de control. Sin embargo, si su valor se ha determinado de manera fiable por un método de referencia, se puede usar también el mismo material para comprobar la exactitud o para calibrar un instrumento. Si es posible, se deben usar controles con valores altos, bajos y normales. Es aconsejable usar al menos una muestra de control por cada lote incluso si el lote es muy pequeño. Ya que se pretende que los controles simulen un muestreo al azar, se deben tratar exactamente igual que las muestras de los pacientes. Los resultados obtenidos con las muestras de control se pueden trazar en un gráfico como se describe más adelante. El valor medio y la DE de la muestra de control se deben establecer en primer lugar, como se describe previamente, en el laboratorio donde se llevan a cabo las pruebas de las muestras. En un papel milimetrado aritmético se dibuja una línea horizontal, que representa la media (como una base) y, en una escala apropiada de cantidad y unidad, se dibujan líneas por encima y por debajo de la media, representando +2 DE y –2 DE. Se trazan las mediciones sucesivas de la muestra de control. Si la prueba es satisfactoria, los resultados secuen-

26 Control de calidad

Figura 26.1. Gráfico de control (gráfico de Levey–Jennings) con un analizador del recuento sanguíneo automático. El valor medio de cada componente del recuento sanguíneo aparece a la izquierda junto con los límites superior e inferior para una prestación satisfactoria, que se ha ajustado a +2 DE y –2 DE, respectivamente.

LS Objetivo Pruebas LI 4,73 4,16 RE 3,59 14,2 12,4 Hb 10,6 0,426 Hto 0,370 0,314 96,4 VCM 91,0 85,6 30,9 HCM 30,0 29,1 33,9 CHCM 33,0 32,1

ciales oscilan alrededor del valor medio, y menos del 5% de los resultados caen fuera de 2 DE. La figura 26.1 ilustra un gráfico de control de un sistema automático; se puede emplear un principio similar para métodos sencillos, cuyos datos se trazan de manera manual (fig. 26.2). Lo siguiente indica un fallo en la técnica, en el instrumento o en el reactivo: 1. Un resultado muy desviado fuera de 3 DE indica un craso error o «torpeza». 2. Uno o dos resultados en, o más allá de, los límites de +2 DE o –2 DE indica un error aleatorio. 3. Diversos resultados similares consecutivos a un lado de la media indica un fallo en la calibración que origina un sesgo permanente. 4. Valores consecutivos fluctuantes subiendo y bajando en 2 DE indican una imprecisión. El fallo puede estar en los reactivos o en los utensilios del laboratorio o puede deberse a un ajuste o calibración incorrecta del instrumento, a un error técnico o incluso a

152 +2 DE 150 148

g/l

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146 144 142 140 –2 DE 138 136 134 0

5

10

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Tiempo (días)

Figura 26.2. Gráfico de control para la hemoglobinometría por el método manual. Los límites para la prestación satisfactoria se han establecido en ±2 DE.

un error administrativo al transcribir los resultados. Antes de hacer una investigación exhaustiva, hay que repetir la prueba con otra muestra, y se debe considerar la posibilidad de que la incoherencia pueda ser resultado del deterioro o de la infección del lote de materiales. Es improbable que este proceso de control detecte un error en una muestra individual, ya que sólo se puede detectar mediante comprobaciones correlativas (descritas más adelante). Para una hemoglobinometría, puede ser útil emplear tanto la sangre total como la lisada para comprobar el control de calidad, porque las diferencias en los resultados obtenidos con estas dos preparaciones ayudan a identificar errores debidos a una dilución incorrecta, una mezcla inadecuada o un fallo del reactivo en conseguir una lisis completa. Si la muestra de control se incluye en cada lote a lo largo del día, su medida no debería diferir más del CV establecido. Una tendencia de valores en aumento o descenso secuencial en medidas repetidas es indicativa de una desviación.

Pruebas por duplicado en las muestras de los pacientes Las pruebas por duplicado en las muestras del paciente16 representan otra forma de comprobar la precisión en el trabajo rutinario. Para comenzar el proceso, analizar 10 muestras consecutivas por duplicado bajo condiciones controladas. Calcular la diferencia entre los pares de resultados, y obtener la DE (v. pág. 594). Las medidas siguientes por duplicado de cualquier muestra del mismo lote no deben diferir entre ellas más de 2 DE. Este método detecta los errores aleatorios, pero no detecta una calibración incorrecta. Tampoco es sensible a la desviación gradual, la cual se puede detectar, sin embargo, si se lleva a cabo la medida por duplicado en un lote posterior, siempre que la muestra no se haya alterado durante el almacenamiento. Si la prueba se hace siempre mal o tiene un fallo inherente, la DE es amplia. Estos procedimientos son adecuados tanto para los métodos manuales como para los automáticos; no son prácticos para los recuentos sanguíneos de rutina en un labora-

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

torio con mucho trabajo, donde se deben comprobar tres o cuatro muestras de un lote de vez en cuando, como una comprobación grosera de la coherencia.

Comprobación «delta» El recuento sanguíneo de cualquier paciente no debe diferir de sus propios recuentos obtenidos durante las 2-3 semanas previas en más de una cierta cantidad que tenga en cuenta tanto el CV de las pruebas como la variación fisiológica, siempre que la situación clínica del paciente no se haya alterado significativamente. Con los contadores automáticos, las diferencias, por lo general, no deben ser mayores del 10% para la Hb y el RE, 20% para el RL y 50% para el recuento plaquetario. Este procedimiento detecta cualquier deterioro de los aparatos y los reactivos que puedan suceder entre las pruebas. Las pruebas también se pueden desarrollar en sangre de individuos sanos, cuyo recuento sanguíneo permanece virtualmente constante día tras día, sólo sujeto a cambios fisiológicos (v. pág. 16).

Uso de los datos del paciente para el control de calidad En los hospitales con al menos 100 solicitudes de pruebas cada día no debería haber una variabilidad diaria significativa en las medias de su índices de eritrocitos, obtenidos por medio de un contador de sangre automático, siempre que la población de pacientes permanezca estable, y que las muestras de una fuente clínica en concreto no se procesen todas en el mismo grupo y que, por tanto, influyan desproporcionadamente en la media. Asumiendo que la población de muestras es estable, cualquier cambio significativo en las medias de los eritrocitos indicará un cambio en la calibración del instrumento o una desviación debida a un fallo en su función. El procedimiento fue desarrollado por Bull17,18 utilizando un algoritmo computarizado para estimar las medias diarias de los índices de eritrocitos de los pacientes (volumen corpuscular medio [VCM], hemoglobina corpuscular media [HCM] y concentración de hemoglobina corpuscular media [CHCM]). Para comenzar este programa, es ne-

LS Objetivo Pruebas LI 4,50 4,37 4,24 13,3 12,9 Hb 12,5 0,390 Hto 0,373 0,356 88,8 VCM 85,4 82,0 31,0 HCM 29,5 28,0

RE

22/05/2003 15:48

cesario analizar primero muestras de al menos 300-500 pacientes con un contador de sangre automático durante varios días, y establecer las medias de HCM, VCM y CHCM. Después, usando el algoritmo, es posible analizar las muestras en lotes sucesivos de 20 muestras. Trazando estos datos en una gráfica, cualquier desviación de estos tres índices se puede reconocer fácilmente y es posible usarla para identificar fallos en los instrumentos; una DE aumentada significa pérdida de precisión. Para asegurar que cada lote es representativo, las muestras se deben escoger al azar antes del análisis y, si es posible, dentro de un lote; no deben provenir más de siete de la misma fuente clínica o tener el mismo trastorno clínico. El método ya está incorporado a numerosos contadores de sangre automáticos (fig. 26.3). En los laboratorios que utilizan métodos manuales, se puede aplicar una simple adaptación del mismo principio limitado a la CHCM y excluyendo los resultados de cualquier situación clínica especial con probabilidad de un sesgo específico. A partir de las medias diarias de todas las mediciones durante 10 días de trabajo consecutivos se establece una media y una DE diaria global. La media de la CHCM se calcula al final de cada día. Si la prueba no varía en más de 2 DE, se considera satisfactoria, pero puede ser engañosa si hay un error en la misma dirección tanto en la hemoglobina como en el Hto. Los resultados se pueden mostrar gráficamente, como se ilustra en la figura 26.4. Es útil para validar lotes sucesivos de calibradores. Algunos fabricantes utilizan un procedimiento similar específico del instrumento, ya que reúnen los datos enviados por los usuarios de sus aparatos a través de conexiones de red. Esto les permite mantener una comprobación constante de las prestaciones globales de estos instrumentos y detectar cualquier recalibración que se necesite o cualquier investigación de los fallos.

Comprobación de la correlación La comprobación de la correlación implica que cualquier resultado inesperado tiene que comprobarse para ver si se puede explicar por motivos clínicos o si se correlaciona con otras pruebas. Así, por ejemplo, una hemoglobina inesperadamente alta o baja puede explicarse por una transfusión sanguínea o una hemorragia, respectivamente. Una CHCM baja se tiene que confirmar demostrando eritrocitos

DE Media Datos CV Fecha 4,32 4,32 12,8 12,8 0,362 0,362 83,8 83,8 29,6 29,6

Figura 26.3. Control de calidad basado en los datos de los pacientes. Se controlan los recuentos automáticos de sangre a partir de los resultados medios de los índices de VCM, HCM y CHCM de los eritrocitos. Las medias predeterminadas se muestran junto con los límites superior (LS) e inferior (LI) para un control satisfactorio.

26 Control de calidad

CHCM

335 330 325 +2 DE 320 315 310 305 –2 DE 300 295 290 285 0

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Tiempo (días)

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Figura 26.4. Control de calidad basado en los datos de los pacientes. Control de los recuentos manuales de sangre usando la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) como indicador.

hipocrómicos en una extensión de sangre con tinción de Romanowsky; un VCM elevado se puede correlacionar con una macrocitosis. De manera similar, hay que examinar las extensiones sanguíneas para confirmar una marcada leucocitosis o una leucopenia, una trombocitosis o una trombocitopenia, para distinguir entre plaquetas y fragmentos de eritrocitos o, por el contrario, entre plaquetas gigantes y eritrocitos de tamaño normal (p. ej. v. fig. 5.95), o para comprobar un recuento de leucocitos erróneamente alto, como resultado de eritrocitos incompletamente lisados en las hemoglobinopatías o en las hepatopatías (aunque también hay que tener cuidado con la extensión sanguínea por sí misma, ya que puede ser engañosa si no se ha hecho o se ha teñido correctamente). El registro de los datos del recuento sanguíneo en formularios de informe acumulados o en gráficos es una buena práctica clínica y proporciona un sistema de control de calidad interno, haciendo más fácil detectar un resultado aberrante cuando se compara con unos valores basales previamente determinados. Es especialmente útil para detectar los errores descabellados ocasionales, originados por etiquetar incorrectamente las pruebas, por una suspensión inadecuada de la sangre antes del muestreo, por una coagulación parcial de la muestra sanguínea o por deterioro durante el almacenamiento. Debe dudarse de un resultado discrepante sin aparente razón clínica, hasta que se confirme mediante la repetición de la prueba en una muestra fresca. La aparición de una discrepancia similar en dos muestras diferentes en el mismo día podría sugerir que las dos muestras se han mezclado.

lizan, se establece un valor objetivo y un rango aceptable alrededor de ese valor, y se juzga la prestación de cada participante en concreto. Es importante que las prospecciones se desarrollen a intervalos regulares, aunque la frecuencia puede variar, dependiendo de la importancia diagnóstica de esa prueba particular, con qué frecuencia se solicitan y su fiabilidad técnica. Así, por ejemplo, en el plan nacional (NEQAS) de hematología del Reino Unido, las muestras se distribuyen a intervalos de 4 semanas para el recuento celular y cada 3 meses para la mayoría de las otras pruebasc. Los principales propósitos del EQAS son asegurar un desarrollo fiable de los laboratorios individuales y alcanzar la armonización o concordancia entre los mismos. Sin embargo, algunos analizadores manejan la sangre conservada de manera diferente a las muestras rutinarias e, incluso si están bien calibrados, los distintos tipos de contador pueden diferir en sus respuestas a las muestras EQAS22,23. Puede hacerse necesario, por tanto, analizar los resultados por separado de los diferentes grupos de instrumentos. Cuando hay diferencias inexplicables en los recuentos de muestras EQAS con diferentes aparatos dentro de un mismo laboratorio, los recuentos se deben hacer en muestras de sangre fresca con EDTA con los diferentes aparatos, para confirmar su capacidad real de comparación, y, si fuera necesario, recalibrar alguno de ellos para alcanzar la concordancia. Los EQAS también tienen otras funciones complementarias: 1. Recoger información acerca de la fiabilidad de métodos, materiales y equipos particulares. 2. Identificar problemas con cualquier dispositivo de diagnóstico médico in vitro (IVDMD) que requiera una reacción por parte del fabricante y/o un informe a la autoridad nacional responsable como se describe en la EN 14136 (v. pág. 563). 3. Proporcionar información acerca de las prestaciones requeridas para obtener una licencia o una acreditación. 4. Identificar aquellos laboratorios cuyas prestaciones ofrezcan un estándar de operativa. 5. Recomendar procedimientos actuales para varias pruebas de análisis, organizar talleres para la formación y el entrenamiento del personal del laboratorio, y dar consejos en las guías de buenas prácticas.

Análisis de los datos de EQA Índice de desviación

VALORACIÓN EXTERNA DE LA CALIDAD Un plan de valoración externa de la calidad (EQAS)10,19-21 es un complemento importante al control interno. Incluso tomando todas las precauciones para alcanzar la exactitud y precisión en el laboratorio, aparecen errores sólo detectables mediante una valoración objetiva externa. El principio es que se envía el mismo material desde un centro nacional o regional a numerosos laboratorios participantes, al menos 20. Los resultados que se devuelven al centro EQAS se ana-

La media o la mediana y la desviación estándar se calculan a partir de los resultados devueltos por los participantes. Un laboratorio concreto puede entonces comparar sus resultados en la prospección con los de otros laboratorios, y con sus propios resultados anteriores mediante el índice de desviación (ID) (o la puntuación-z, como se llama a veces). Se calcula como la diferencia entre el resultado con-

c

La información sobre UKNEQAS está disponible en la página web www.ukneqas.org.uk (correo electrónico: [email protected]).

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

creto del laboratorio y la media o la mediana relativa a la DE. Por tanto: [Resultados reales de la prueba – media o mediana ajustadas] ID = DE ajustada Cuando los resultados tienen una distribución gaussiana, la media y la DE se ajustan en un cálculo preliminar excluyendo todos los resultados superiores e inferiores al 5%. Cuando la distribución de los resultados no es gaussiana, se debe usar la mediana mejor que la media. En este caso, la DE se calcula de la siguiente manera: Extensión del 50% central ÷ 1,349 En lugar de emplear la DE ajustada como se describe previamente, la DE se puede calcular a partir de un CV constante, que tiene en cuenta la variación técnica del método, la utilidad clínica de la prueba y el rango crítico de medida para la discriminación diagnóstica. En este método, un ID (puntuación) de menos de 0,5 denota una prestación excelente, una puntuación entre 0,5 y 1,0 es satisfactoria, y una puntuación entre 1,0 y 2,0 aún es aceptable. Una puntuación mayor de 2,0 sugiere que se debería comprobar la calibración del analizador, mientras que un ID >3,0 indica un defecto grave que requiere atención.

Monitorización consecutiva Es esencial controlar los resultados EQA en estudios consecutivos, fijándose en cualquier fluctuación en el ID. Una forma adecuada de cuantificar esto es añadiendo 6 puntos ID recientes (p. ej., de 2 muestras en los últimos 3 estudios); cualquier valor >3,5 se redondea a la baja a 3,5 para evitar un valor aislado muy alto que tenga un efecto excesivo en el cálculo. El total se multiplica entonces por 6. Un fallo en el envío de los resultados en un estudio sufre una penalización de 50. Una puntuación de 100 o más indica una prestación insatisfactoria persistente. Se espera, sin embargo, que los participantes corrijan cualquier problema antes de llegar a esta etapa.

Método aparte del consenso El método «aparte del consenso», que es un refinamiento del procedimiento no gaussiano descrito previamente, se usa en el UKNEQAS para la coagulación sanguínea. Se calcula la media, y todos los resultados de los participantes se clasifican en cinco grados de la siguiente manera:

La prestación de una prueba en concreto se valora a partir de los grados obtenidos en dos ejercicios consecutivos. Una prestación insatisfactoria aparece cuando la combinación es de D-D, E-C, E-D o E-E.

Valores diana y sesgos Se puede asumir que los valores reales de una prueba son el resultado obtenido de la mejor prestación de los participantes seleccionados en el estudio, o por expertos utilizando métodos de referencia, o por el consenso tras el ajuste, como se describe previamente. Éste es el valor diana (VD) que deben alcanzar todos los participantes. El sesgo porcentual de los resultados de un participante en concreto se puede calcular de la siguiente manera: [(R – VD) ÷ VD] × 100 El patrón del sesgo en estudios sucesivos indicará si hay un error constante de calibración o un fallo progresivo, o bien si el defecto original ha sido corregido.

Trazado (xy) de Youden El trazado de Youden es un método útil para relacionar mediciones en dos muestras en un estudio para proporcionar una visualización gráfica y, cuando los resultados de los participantes no sean satisfactorios, para distinguirlos entre un sesgo persistente o un error aleatorio. Los resultados de las dos muestras se trazan en los ejes horizontal (x) y vertical (y), respectivamente, y se dibujan las desviaciones estándar (2 DE o 3 DE) de las dos series, como se muestra en resumen en la figura 26.5.

500

Muestra B

570

B2

400

300

200 B1

100 100

1. Grupo A. El 25% de todos los resultados que están inmediatamente adyacentes a la mediana y por encima, y el 25% de los que están inmediatamente adyacentes a la mediana y por debajo. 2. Grupo B. El siguiente 10% a cada lado de A. 3. Grupo C. El siguiente 5% a cada lado de B. 4. Grupo D. El siguiente 5% a cada lado de C. 5. Grupo E. El 5% final a cada lado de D (y también los no participantes).

200

300 400 500 Muestra A

600

Figura 26.5. Gráfico de Youden (xy). El rango de las desviaciones estándar (DE), calculado a partir de los resultados globales con la muestra x y la muestra y, respectivamente, se dibuja en los ejes x e y; los resultados emparejados concretos se dibujan entonces en la gráfica. Los resultados del cuadrado central son satisfactorios; aquellos situados en B demuestran un sesgo persistente con medidas que son demasiado bajas (B1) o demasiado altas (B2), mientras que los resultados en otras áreas indican errores aleatorios.

26 Control de calidad

Los resultados que caen en el bloque central son satisfactorios, los del bloque B indican un sesgo persistente, que puede ser positivo (a la derecha) o negativo (a la izquierda), mientras que los resultados en otras áreas indican errores debidos al azar (incoherencia) en las dos muestras.

respecto al valor diana, que debe ser un consenso entre los resultados de los participantes y los resultados de una revisión. Hay que tener en cuenta el significado clínico y diagnóstico de un resultado incorrecto o confuso.

Pruebas cualitativas Comprobación de la metodología A veces es útil comprobar los componentes de un método por separado. Así, se pueden utilizar muestras apropiadas para comprobar la adecuación de la mezcla para asegurar la homogeneidad de la muestra, la fiabilidad del proceso de dilución y cómo se usa un instrumento. Por ejemplo, un estudio puede incluir un par de muestras de sangre total idénticas y de lisados de la misma muestra para medir la hemoglobina, junto con una solución de hemoglobina prediluida.

Significado clínico Para valorar la prestación, el uso de límites basados en la DE en algunos casos es demasiado rígido y, en otros, es demasiado indulgente. Para asegurar que los resultados sean clínicamente fiables, deben estar dentro de un cierto porcentaje del valor asignado. Esto debe tener en cuenta la inevitable imprecisión del método y las variaciones normales diurnas. Los siguientes límites son adecuados para cumplir estos requisitos en la práctica: Hb y RE (por contador de células) Hto, VCM, HCM, CHCM Recuento de leucocitos Recuento de plaquetas Vitamina B12, folato, hierro, ferritina Cuantificación de HbA2 y HbF

3-4% 4-5% 8-10% 10-15% 20% 5%

Pruebas semicuantitativas Las reacciones del tipo lisis, aglutinación o cambio de color se registran como 0, 1+, 2+, 3+ o 4+. La valoración de la prestación se debe basar en el grado de divergencia con Tabla 26.1.

Para valorar las pruebas cualitativas o interpretativas (p. ej., la morfología de las extensiones de sangre), los resultados de los participantes se comparan con el consenso obtenido de un lista de expertos o por concordancia del 75% o más de los participantes. Las características informadas se clasifican según su significado clínico, teniendo en cuenta los trastornos médicos específicos, de la siguiente manera: 1. Esencial para el diagnóstico: 5 puntos. 2. Es probable que influya en la decisión diagnóstica: 2-3 puntos. 3. Podría ser útil para llegar a un diagnóstico, pero sólo como una consideración secundaria: 1 punto. 4. No proporciona información útil: 0 puntos. A todas las observaciones correctas se les da una puntuación positiva, y las observaciones falsamente positivas se restan según la clasificación. El resultado se expresa como un porcentaje de la puntuación total posible establecida por los revisores.

PROTOCOLO DE GARANTÍA DE CALIDAD PARA LOS LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO Los procesos que se deben incluir en un programa de control de calidad varían con las pruebas que se llevan a cabo, los instrumentos utilizados y (sobre todo si éstos incluyen un sistema de recuento completamente automatizado), la dimensión del laboratorio y el número de muestras que se maneja, los ordenadores de los que se dispone y la cantidad de tiempo que se puede dedicar al programa. Se deben rea-

Procedimientos de garantía de la calidad

Calibración con los estándares de referencia

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Instrumentos. A intervalos de 6 meses, si la gráfica de control o el EQA indica sesgo o fluctuación en los resultados, y tras cualquier reparación/servicio Sistemas de dilución. Al inicio y a intervalos de 1 o 2 semanas Gráfica de control con el material de control. A diario o con mayor frecuencia con cada lote de muestras Comprobación delta en muestras de pacientes seleccionadas. A diario Pruebas por duplicado en las muestras de dos o tres pacientes. Si la gráfica de control o la comprobación delta muestran discrepancias Análisis de los resultados del paciente: constancia de las medias de VCM, HCM, CHCM. A diario Valoración de la correlación de los informes de las pruebas Resultados acumulativos. Siguiendo las pruebas previas Extensiones sanguíneas. Si aparecen resultados de las pruebas inusuales y/o disminución en el recuento Estado clínico Prestación del EQAS

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lizar algunos de los formularios de control interno de la calidad, y hay que participar en un plan de valoración externa de la calidad si se dispone de él. Hay que llevar a cabo a diario algunos procesos de control, y también se tienen que hacer a intervalos apropiados otras comprobaciones de las prestaciones. Esto último es especialmente importante cuando hay un cambio en la plantilla o cuando haya habido un servicio de mantenimiento o reparación en el equipo. El protocolo extenso se resume en la tabla 26.1. Todo el personal del laboratorio necesita formación en estos aspectos diversos de la garantía de la calidad. Un manual de formación útil de la OMSd describe los principios y los métodos, junto con ejercicios prácticos para ilustrarlos9. Otra buena fuente para la formación es la página web de J. O. Westgard (www.westgard.com); incluye la «lección del mes» y otros temas actuales que se ponen al día regularmente.

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27 Hematología en laboratorios de recursos escasos Imelda Bates y Barry Mendelow Introducción: tipos de laboratorio Organización de los servicios de laboratorio clínico Nivel A. Instalaciones en barrios incluyendo centros de salud Nivel B. Hospitales de distrito Nivel C. Hospitales centrales y universitarios Disponibilidad de pruebas en cada nivel Nivel A Nivel B Nivel C Microscopios Pruebas hematológicas «esenciales» Coste por prueba Fiabilidad diagnóstica Utilidad clínica Mantenimiento de la calidad y fiabilidad de las pruebas Control de calidad del método de una prueba (calidad técnica) Pruebas hematológicas básicas Medición de la hemoglobina

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INTRODUCCIÓN: TIPOS DE LABORATORIO En la mayoría de los países existen probablemente algunos laboratorios con recursos limitados, pero en los países de escasos recursos hay muy pocos laboratorios con técnicos altamente cualificados y equipamiento sofisticado; en estos países no es raro que las pruebas de laboratorio las lleven a cabo enfermeras y celadores en los despachos de consulta de pacientes ambulatorios, pasillos y centros de salud rurales. El personal escaso, el desánimo, los equipos inadecuados y el abastecimiento errático son problemas crónicos de los laboratorios de los países pobres y estos factores tienen un impacto importante en la gama y la calidad de los servicios que pueden ofrecerse. Muchos de los laboratorios más pequeños son multifuncionales y realizan hematología, parasitología, bioquímica clínica y pruebas microbiológicas. En las instituciones más grandes normalmente existe un servicio de transfusiones sanguíneas y, al menos que haya un servicio nacional de hematología, el personal de laboratorio será responsable de la selección de

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Aparatos de medición de hemoglobina de lectura directa Escala de color de la hemoglobina Hematocrito Recuento celular manual mediante cámaras de recuento Recuento leucocitario total Recuento plaquetario Morfología de la sangre periférica Prueba de fragilidad osmótica modificada (prueba en un tubo) Prueba de detección de la hemoglobina E Servicios de laboratorio para el manejo de VIH/sida: recuento de células T CD4 positivas Gestión del laboratorio Comunicación entre laboratorios Transporte de muestras Formación del personal Interacción del personal clínico Salud y seguridad

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donantes, la recogida de sangre y la evaluación de la misma. Si no se organizan laboratorios de salud pública, se requerirá que los laboratorios asistenciales proporcionen datos de elevada calidad de vigilancia de la salud para el seguimiento epidemiológico y de salud pública. En algunos países de escasos recursos las dificultades se agravan por el hecho de que los servicios de salud están saturados por las crecientes epidemias de VIH/sida (virus de la inmunodeficiencia humana/síndrome de inmunodeficiencia adquirida), tuberculosis y malaria. El diagnóstico y seguimiento de estas enfermedades requieren un sistema de laboratorios riguroso y fiable. Así, el diagnóstico de la malaria debe confirmarse mediante una prueba de laboratorio, porque otras enfermedades pueden parecerse clínicamente a la malaria1. El diagnóstico de tuberculosis puede requerir un aspirado y cultivo de médula ósea, así como un examen de biopsia por trepanación, especialmente en los pacientes que son también VIH positivo, porque en estos casos las pruebas de esputo para organismos ácidorresistentes son frecuentemente negativas2. El seguimiento de la progresión 573

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a sida y de la efectividad de la terapia antirretroviral requiere determinaciones de hemoglobina, recuento de linfocitos CD4 positivos y determinaciones de carga viral en el plasma3-5. El propósito de este capítulo es apuntar hacia la dotación de un servicio de hematología efectivo a pesar de las serias limitaciones. En la planificación de este servicio es necesario identificar qué instalaciones se necesitan y planificar una red de referencia en el caso de que un problema clínico necesite una investigación que supere las instalaciones y la capacidad local. Así, por ejemplo, el manejo exitoso de los tumores hematológicos en los países de escasos recursos podría implicar a hematólogos locales entusiastas asociados con instituciones de países desarrollados, con la consiguiente adaptación de los protocolos estándar y la mejora de las instalaciones locales con aportaciones solidarias6.

ORGANIZACIÓN DE LOS SERVICIOS DE LABORATORIO CLÍNICO En los países de escasos recursos, los servicios de laboratorio clínico pueden clasificarse en tres niveles de acuerdo a su dimensión, dotación de personal y trabajo que asumen. Existen: a) instalaciones de barrios incluyendo los centros de salud; b) hospitales de distrito, y c) hospitales centrales, regionales y universitarios (fig. 27.1).

Nivel del laboratorio Servicios hematológicos realizados Centros de salud Cálculo simple de hemoglobina Detección del paludismo Prueba de VIH Hospitales de distrito Medición de la hemoglobina Examen de frotis sanguíneos (morfología y recuento leucocitario diferencial) Recuento plaquetario y leucocitario total Detección de hemoglobina de drepanocitosis (si procede) Prueba rápida del paludismo Recuento de CD4 Hospitales centrales/ Recuento sanguíneo automático regionales Detección de G6PD Electroforesis de la hemoglobina Inmunofenotipificación Cálculo de la carga viral VIH Pruebas básicas de coagulación Control de anticoagulantes orales Procesamiento de aspirados de médula ósea Pruebas de histocompatibilidad cruzada y detección de anticuerpos Producción de componentes sanguíneos básicos Centro nacional Todas las pruebas relevantes de referencia

Figura 27.1.

Nivel A. Instalaciones en barrios incluyendo centros de salud Generalmente, los «laboratorios» de nivel A proporcionan los medios para determinar si un paciente debería ser remitido a un hospital local. Esto podría consistir simplemente en la determinación de la concentración de hemoglobina (Hb) durante la consulta clínica (es decir, una prueba de diagnóstico inmediato) o puede realizarse en una habitación anexa donde, a menudo, las pruebas de laboratorio las realizan enfermeras, auxiliares o celadores sin formación técnica. El equipo hematológico disponible podría incluir un método simple para la determinación de hemoglobina y un microscopio para el examen de un frotis para tuberculosis o malaria. Sin embargo, el mantenimiento de los microscopios en las áreas rurales suele ser deficitario, lo que puede comprometer significativamente la calidad de los resultados (v. pág. 601).

Nivel B. Hospitales de distrito Los laboratorios de los hospitales de distrito son habitualmente multiuso y realizan pruebas microbiológicas y bioquímicas, así como hematológicas. El personal de laboratorio consiste en uno o dos técnicos con formación, ayudados por auxiliares que, a menudo, tienen poca o ninguna formación. El equipo mínimo disponible para hematología es un microscopio y una centrífuga y, quizás, un colorímetro para medir la concentración de hemoglobina.

Redes de laboratorios.

Nivel C. Hospitales centrales y universitarios A este nivel, el personal de laboratorio recibe una formación multidisciplinaria y cada laboratorio generalmente tiene un director técnico especialista, en tanto que la mayoría del personal más antiguo habrá recibido formación de posgrado en la disciplina escogida. El equipamiento generalmente incluye centrífugas, colorímetros, microscopios, equipos de electroforesis de hemoglobina y posiblemente centrífugas de banco de sangre para la separación de sus componentes. En estos laboratorios pueden encontrarse analizadores automáticos de hematología. En muchos casos, éstos habrán sido suministrados por agencias donantes, pero con frecuencia se carece de fondos a largo plazo para la ayuda al mantenimiento y la formación para utilizar estos sistemas y, consecuentemente, podrían ser poco fiables o no usarse, debido a la escasez de reactivos apropiados y al inadecuado mantenimiento y formación del personal.

DISPONIBILIDAD DE PRUEBAS EN CADA NIVEL En los países de escasos recursos, las pruebas de hematología que están disponibles en los distintos niveles de asistencia sanitaria son muy variables y dependen de las necesidades clínicas locales, los equipos disponibles, el número

27 Hematología en laboratorios de recursos escasos

de personal de laboratorio y su cualificación técnica. A continuación se hace una descripción general de las pruebas que probablemente se requieran, aunque no necesariamente todas pueden estar disponibles en los niveles especificados.

• • •

Nivel A • Determinación de hemoglobina por un método simple (v. pág. 577). • Detección de malaria en gota gruesa y fina de sangre periférica (v. pág. 61). • Pruebas serológicas de VIH apoyadas por asesoramiento y análisis voluntarios.

•

• •

fológica (v. pág. 102) y evaluación de los niveles de hierro (v. pág. 267). Examen de la médula ósea por biopsia (v. pág. 108). Determinación del grupo sanguíneo y pruebas cruzadas (v. cap. 20). Identificación de anticuerpos del grupo sanguíneo (v. cap. 19). Pruebas básicas de coagulación (tiempo de protrombina, tiempo de trombina y tiempo de tromboplastina parcial activado) (v. pág. 342). Control de anticoagulantes orales (v. pág. 399). Separación de la sangre total en concentrados celulares, plasma y, ocasionalmente, plaquetas (v. pág. 564).

Microscopios Nivel B • Determinación de hemoglobina (v. pág. 24). • Morfología de sangre periférica, especialmente para identificar la causa de anemia (v. cap. 5)a. • Recuento plaquetario y leucocitario total (v. pág. 578). • Recuento leucocitario diferencial (v. pág. 32). • Recuento de linfocitos CD4 (v. pág. 582; v. también página 288). • Detección de malaria por frotis de sangre periférico grueso y fino (v. pág. 61) o pruebas inmunológicas rápidas para Plasmodium falciparum y posiblemente otras especies (v. pág. 518). • Prueba de detección de la hemoglobina causante de anemia drepanocítica en áreas en las que ésta es relevante (v. pág. 252).

Nivel C

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Además de las pruebas realizadas en el nivel B, los servicios de hematología ofrecidos por el nivel C podrían incluir los siguientes: • Medición automática de Hb, VCM, HCM, CHCM, recuento plaquetario y recuento leucocitario total y diferencial (v. pág. 32). • Electroforesis de hemoglobina o cromatografía fina de alta resolución (v. cap. 12). • Cuantificación de hemoglobina A2 y hemoglobina F (v. págs. 255 y 259). • Detección de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) (por mancha fluorescente o método de reducción de metahemoglobina) (v. pág. 187). • Determinación del fenotipo inmunológico por citometría de flujo (v. cap. 14). • Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos para el diagnóstico de mutaciones asociadas a tumores hematológicos (v. cap. 21). • Determinación de carga viral plasmática de VIH. • Tinción de frotis de médula ósea para evaluación mora

Existe un banco de ayuda disponible sobre morfología de la Organización Mundial de la Salud (OMS)7.

El microscopio es la pieza más importante del equipo de laboratorio en los países de escasos recursos. Es esencial para el diagnóstico de la anemia, la tuberculosis, la malaria y otras infecciones parasitarias, así como para realizar el recuento celular absoluto y diferencial. La evaluación fiable de estas características morfológicas requiere que esté limpio y correctamente montado con las lentes alineadas y luz directa o reflejada para asegurar la obtención de imágenes claras y con magnificación elevada. Si no se realiza un buen mantenimiento del microscopio para garantizar su correcto funcionamiento mediante controles rutinarios y revisiones técnicas periódicas, ello puede conducir a diagnósticos imprecisos y a un uso ineficaz del tiempo del técnico8,9. El mantenimiento rutinario del microscopio se describe en la página 601.

PRUEBAS HEMATOLÓGICAS «ESENCIALES» A pesar del coste relativamente alto del funcionamiento del servicio de laboratorio y el bajo presupuesto para asistencia sanitaria per capita en los países de escasos recursos, existen muy pocos datos disponibles en los que basar las decisiones racionales sobre las pruebas de laboratorio «esenciales»10,11. En muchos de estos países las decisiones sobre los laboratorios las realizan a nivel central los planificadores de la asistencia sanitaria, cuyos intereses son más amplios que los del director del laboratorio, pero es importante asegurar que se respete el punto de vista del director del laboratorio. Para decidir qué pruebas son «esenciales», es importante tener información fiable acerca de las necesidades clínicas y de salud pública de la comunidad local y colaborar con los planificadores sanitarios en el pronóstico de las tendencias a medio y largo plazo. La necesidad de esta información es especialmente urgente en los países donde la epidemia del VIH/sida ha supuesto una carga insoportable para los servicios de salud. Para asegurar el coste-efectividad de los servicios de laboratorio, deberían eliminarse las pruebas que no demuestren utilidad e introducirse nuevas pruebas sobre las que existan evidencias independientes de su efectividad, como se describe en el capítulo 24, página 537. Para los labora-

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torios sin acceso a sistemas de datos informatizados, se puede obtener un índice realista de coste-efectividad mediante la siguiente fórmula, que tiene en cuenta varios factores3: 100 A × 100 × B C donde A = coste por prueba; B = su fiabilidad diagnóstica, y C = su utilidad clínica. Sin embargo, en los laboratorios con instalaciones limitadas, estos factores deben ser interpretados con precaución, porque no es posible elaborar una lista de pruebas que sea aplicable a todos los países o incluso a diferentes regiones de un mismo país. Deberían tenerse en cuenta los siguientes aspectos.

Coste por prueba A menudo el coste de una prueba se calcula a partir del precio de los reactivos dividido entre el número de pruebas realizadas. Sin embargo, esto simplifica en exceso la situación y no es lo bastante preciso para constituir la base para las decisiones políticas nacionales y la asignación del presupuesto. Los factores que se necesita tener en cuenta, cuando se calcula el coste anual total de un laboratorio, incluyendo una fórmula para calcularlo, se describen en la página 537. Como ejemplo del efecto de varios factores en el coste, en el laboratorio de un hospital de distrito típico en África, la microscopia de malaria y tuberculosis constituyen el 22 y 46%, respectivamente, del número de pruebas realizadas, pero cuando estos factores se tienen en cuenta, el frotis para tuberculosis supone el 43% del presupuesto del laboratorio y la microscopia para malaria, el 9%11.

Fiabilidad diagnóstica La calidad de las pruebas llevadas a cabo por un laboratorio debería evaluarse regularmente; los sistemas para realizarlo están bien establecidos (v. cap. 24). La calidad de la prueba influirá en su utilidad. Por ejemplo, si el resultado de una prueba en la práctica rutinaria es sólo correcto el 80% de las veces, 1 de cada 5 pruebas será desaprovechada, reduciendo la efectividad de la prueba en un 20%. Además, la prueba incorrecta puede provocar que un paciente reciba un tratamiento inadecuado. También es importante conocer la sensibilidad y especificidad de la prueba y su valor predictivo, como se calcula en la página 537. Sin embargo, en muchos países de escasos recursos es difícil establecer estas estadísticas porque se carece del «patrón oro» de los servicios diagnósticos, necesario para determinar los valores «verdadero positivo» y «verdadero negativo».

Utilidad clínica La evaluación de la utilidad clínica de una prueba debería ser llevada a cabo por un clínico independiente que esté familiarizado con las enfermedades locales y los servicios de apoyo diagnóstico disponibles. Este asesor necesita compa-

rar la práctica clínica actual con la «mejor práctica» localmente aceptada o, si están disponibles, con guías locales. El porcentaje de veces que se sigue la práctica ideal puede calcularse de la observación de una variedad de interacciones clínicas. Por ejemplo, la guía de transfusiones puede recomendar que se hagan transfusiones rutinariamente a niños con Hb inferior a 5 g/dl. El asesor puede registrar cuántos niños con Hb por debajo de este nivel no recibieron transfusión y cuántas transfusiones se administraron sin esperar los resultados de Hb o con concentraciones inapropiadas de Hb. Para cada prueba el asesor necesita juzgar si ha sido apropiadamente pedida y si se emplea para influir en el manejo del paciente o en decisiones de salud pública. El porcentaje de pruebas que no se emplean para orientar las decisiones clínicas proporcionará una cifra para «pérdidas clínicas» de la prueba, que puede introducirse en la fórmula (v. pág. 576).

MANTENIMIENTO DE LA CALIDAD Y FIABILIDAD DE LAS PRUEBAS Paradójicamente, en los laboratorios de escasos recursos, donde el equipamiento y los suministros son limitados y la formación y supervisión pueden ser mínimas, es donde se necesita que el nivel de aptitudes y la motivación, requeridas para mantener la calidad del servicio, sean más elevados. Incluso los laboratorios más básicos deberían asegurar que los procedimientos estén en orden para controlar la calidad (v. cap. 26). Además, para controlar la calidad técnica de cada prueba, la calidad del servicio completo debe asegurarse tanto dentro del laboratorio (control interno) como entre los laboratorios (control externo). Debería existir un borrador de los procedimientos operativos habituales (v. pág. 547) de todos los métodos. Además, para mantener técnicas estandarizadas, hay excelentes recursos de enseñanza y seguimiento de estos procedimientos con mínimos errores. Éstos necesitan ser regularmente revisados y puestos al día, para mantenerse al ritmo de los desarrollos técnicos y los cambios en las circunstancias locales (p. ej., disponibilidad de reactivos, limitaciones técnicas, etc.).

Control de calidad del método de una prueba (calidad técnica) Los métodos para el control de varias pruebas hematológicas se describen en el capítulo 26, pero algunos pueden necesitar adaptación a las circunstancias locales específicas de los países de escasos recursos. Por ejemplo, cada lote de pruebas de detección de drepanocitosis debería incluir controles positivos y negativos; para controlar la constancia de la medida de la hemoglobina, pueden medirse varias veces en el día una muestra con valor elevado y otra con valor bajo.

Control de calidad interno El control de calidad interno es un sistema del laboratorio individual para asegurar que el proceso completo de la

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prueba, más que sólo el elemento técnico, es de calidad aceptable. El control de la calidad mediante el uso de controles que se emplean en el proceso completo, con los que se traza una gráfica de control (v. pág. 566), realzará los problemas con el sistema. Por ejemplo, un recuento leucocitario diferencial impreciso puede indicar problemas en la recogida y el manejo de la muestra, la preparación del portaobjetos, la fijación y el teñido, las interpretaciones morfológicas y la calidad del microscopio, así como una técnica de microscopia inadecuada. Algunas medidas, como la introducción de procedimientos operativos estándar, la formación en el servicio y un programa de mantenimiento de los equipos, están diseñadas para mejorar el rendimiento y prevenir problemas.

Sistema de hemoglobina sanguínea HemoCueb El sistema de hemoglobina sanguínea HemoCue (v. pág. 28) es una máquina portátil de lectura directa que funciona con batería o electricidad, que utiliza cubetas desechables para reacciones en seco. Es preciso y exacto (siempre que sólo se usen las cubetas especificadas) y, a diferencia de la mayoría de los sistemas, no requiere dilución previa de la muestra. Aunque el uso de cubetas desechables de un sólo uso, hace este método relativamente caro, es muy simple de usar por lo que el coste puede compensarse por el ahorro en formación y supervisión.

Evaluación externa de la calidad

Aparato de medida de hemoglobina DHTc

Los principios de la evaluación externa de la calidad (EQA) se describen en la página 569. Las malas comunicaciones y medios de transporte pueden hacer difícil el establecimiento de EQA en los laboratorios de escasos recursos. Aunque la participación en un sistema de evaluación externo de la calidad internacional o nacional, o incluso locorregional, puede estar por encima de las posibilidades de un pequeño laboratorio rural, debería ser posible para ellos vincularse con instalaciones vecinas. Los laboratorios rurales pueden aprovechar los programas con el establecimiento de comunicaciones entre los distritos para el intercambio de materiales y resultados entre diferentes laboratorios. Estos programas podrían incluir visitas de supervisión de un delegado médico de distrito o programas nacionales verticales, tales como el control de la tuberculosis o visitas de educación sanitaria. Si un laboratorio rural detecta un problema con sus resultados, necesita tener un sistema de informes claramente definido a una instalación de un nivel más elevado, que se convierte en responsable para tratar el problema. Pueden establecerse programas de acreditación (v. pág. 547), tanto nacionales como locales, para laboratorios oficialmente reconocidos que están funcionando bien y para ayudar a los que no lo están haciendo.

El aparato de medida de hemoglobina DHT (v. pág. 28) es una máquina portátil, que funciona con batería o electricidad, de lectura directa. Se ha diseñado expresamente para su uso en países tropicales pobres. Utiliza un líquido diluyente estable y económico, y tiene un consumo energético bajo. Es simple de usar, porque la muestra diluida se coloca en una cubeta que se introduce en la máquina. Esto, automáticamente, inicia la lectura y visualización del valor de la hemoglobina.

PRUEBAS HEMATOLÓGICAS BÁSICAS

Medición de hemoglobina © Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

Aparatos de medición de hemoglobina de lectura directa

En el capítulo 3 se describen varios métodos para la medida de la concentración de hemoglobina. El método más preciso, que puede estar disponible en los países de escasos recursos, es el método de la hemoglobina-cianuro (cianometahemoglobina). Sin embargo, éste requiere una fuente de energía y considerable habilidad técnica para llevar a cabo diluciones precisas y para preparar la curva estándar. Los métodos para medir la hemoglobina que son rigurosos, precisos y pueden emplearse por trabajadores sanitarios no cualificados se describen a continuación.

Escala de color de la hemoglobinad En el pasado, se desarrollaron muchos métodos de comparación del color, pero éstos se han quedado obsoletos, porque los colores no eran suficientemente comparables para la sangre o no eran duraderos. Actualmente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha desarrollado una escala de color de la hemoglobina de bajo coste, para la detección de la anemia donde no hay laboratorio12,13. Consiste en una serie de tonalidades de color impresas que representan los niveles de hemoglobina entre 4 y 14 g/dl. Se compara el color de una gota de sangre, recogida en un tipo específico de matriz, con el de la gráfica (fig. 27.2). Pretende detectar la presencia de anemia y estimar su gravedad en incrementos de 2 g/dl (20 g/l). Se ha demostrado la utilidad de la escala en la práctica clínica mediante estudios de campo en clínicas rurales antenatales y centros de salud periféricos14,15. Sin embargo, se debe tener cuidado en seguir exactamente las instrucciones porque la iluminación escasa, que permite secarse a la gota de sangre, y la utilización de un tipo de matriz incorrecto para las tiras de prueba pueden tener efectos negativos sobre el resultadoe. b

Disponible de HemoCue AB, Box 1204, SE-262 23, Angelholm, Suecia. Tel: +46 431 45 82 00. c Disponible de Developing Health Technology, Bridge House, Worlington Road, Barton Mills, IP28 7DX, Reino Unido. Tel: + 44 1603 416058. d Disponible de Copack GmbH, AmKrick 9, 22113 Oststeinbek, Alemania, correo electrónico: [email protected] e Puede obtenerse información sobre la escala de color de Hb en: Department of Essential Health Technology, OMS, 1211 Ginebra 27; Fax: +41 22 791 4836. Véase también tabla 24.6, pág. 544.

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Figura 27.2. Escala de color de la hemoglobina. La tira reactiva teñida que se lee a la derecha indica una anemia grave con un valor de hemoglobina de alrededor de 6 g/dl.

Hematocrito Aunque el hematocrito puede utilizarse para una detección simple de anemia y como una guía aproximada de la precisión de la medición de la hemoglobina, no es un sustituto para una determinación de la hemoglobina correctamente realizada. Además de los problemas técnicos enumerados en la página 28, existe un problema particular con este método en un marco de escasos recursos que puede conducir e errores en el cálculo del hematocrito. La falta de un aparato de mezclado mecánico quiere decir que las muestras pueden estar inadecuadamente mezcladas. La falta de un precinto de alta calidad para los tubos de microhematocrito implica que a menudo se desbordan durante la centrifugación. Debido a que los tubos de microhematocrito son difíciles de etiquetar, las muestras pueden mezclarse en la centrífuga, especialmente cuando la presión de trabajo es elevada y no existe supervisión. El suministro eléctrico errático, la falta de aparatos para medida de la fuerza g y el escaso mantenimiento de los equipos condiciona una centrifugación inadecuada con incompleto empaquetado de los glóbulos rojos.

Recuento celular manual mediante cámaras de recuento El recuento visual de las células sanguíneas es una alternativa aceptable al recuento electrónico leucocitario y plaquetario. No se recomienda para el recuento rutinario de glóbulos rojos, porque el número de células que se pueden

contar en un tiempo razonable en el laboratorio rutinario (p. ej., alrededor de 400) es demasiado escaso para asegurar un resultado preciso (v. más adelante).

Cámaras de recuento La visibilidad de las divisiones en la cámara de recuento16 es tan importante como la precisión de la calibración, por lo que se recomiendan las cámaras con una superficie «metalizada» y las de Neubauer o Neubauer mejoradas rayadas. Éstas tienen nueve áreas cuadriculadas de 1 × 1 mm, que cuando se cubren correctamente con un cubreobjetos grueso especial, contienen cada una un volumen de 0,1 μl de sangre diluida (figs. 27.3 y 27.4). Los cubreobjetos diseñados para montar las preparaciones microscópicas no deben usarse con las cámaras de recuento. La muestra se introduce entre la cámara y el cubreobjetos usando una pipeta o tubo capilar y se visualiza la preparación con un objetivo ×40 y un ocular de ×6 o ×10. Con las cámaras de Neubauer y de Neubauer mejorada, se cuentan las células en 4 u 8 rectángulos horizontales de 1 × 0,05 mm (80 o 160 cuadros pequeños) o en 5 o 10 grupos de 16 cuadrados pequeños, incluyendo las células que tocan los márgenes inferiores y derecho de los cuadrados pequeños.

Recuento leucocitario total Para hacer el recuento leucocitario más fácil, se mezcla la sangre completa diluida con un fluido para lisar los glóbulos rojos y teñir los núcleos de los glóbulos blancos de violeta oscuro-negro.

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Figura 27.3. Cámaras de recuento de Neubauer. El área total rayada es de 3 mm x 3 mm; el área rayada central es de 1 mm x 1 mm. En el área central, 16 grupos de 16 cuadros pequeños están serparados por una raya triple.

Figura 27.4. Cámaras de recuento de Neubauer mejoradas. El área central consta de 25 grupos de 16 cuadros pequeños separados por líneas triples cercanas (que aparecen como líneas gruesas en la fotografía).

Diluyente

cubreobjetos sea de un cristal grueso especial y perfectamente liso, para que cuando se coloque en la cámara de recuento se vean los anillos de difracción. El cubreobjetos debería ser de un tamaño que permita que, cuando se coloque correctamente en la cámara de recuento, el área central rayada se sitúe en el centro del rectángulo que se rellena con la suspensión celular. Si se produce cualquiera de los siguientes defectos de llenado, la preparación debe desecharse y el procedimiento de llenado debe repetirse usando otra cámara limpia y seca:

El diluyente es ácido acético al 2% (20 ml/l) coloreado de violeta claro con violeta de genciana.

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Método Hacer una dilución de sangre 1:20 añadiendo 0,1 ml de sangre bien mezclada (la ausencia de mezclado adecuado es una fuente importante de errores) a 1,9 ml de diluyentef, en un tubo de plástico (o cristal) de 75 × 10 mm. Tras sellar el tubo con una tapa o tapón que ajuste adecuadamente, mezclar la sangre diluida en un mezclador mecánico o manualmente durante al menos 2 min por inclinación del tubo hasta un ángulo de unos 120º combinado con rotación, permitiendo así que las burbujas de aire mezclen la suspensión. Seguidamente, rellenar una cámara de recuento limpia y seca con su cubreobjetos ya colocado. Esto se lleva a cabo simplemente con la ayuda de una pipeta Pasteur o la longitud de un capilar de cristal fuerte que recoge la suspensión por capilaridad. Hay que tener cuidado de que la cámara de recuento se rellene en una vez y que no fluya líquido alrededor del foso. Dejar la cámara en reposo en una plataforma durante al menos 2 min para que las células se fijen, pero no mucho más, porque el secado de los ángulos de la preparación, que se inicia, causa movimiento de las células después de que éstas se han fijado. La plataforma debe estar libre de vibraciones y la cámara no debe exponerse a corrientes o luz solar directa u otras fuentes de calor. Es importante que el f

O bien a un volumen proporcional más pequeño: 20 ml de sangre en 0,38 ml de fluido de lisado.

• • • •

Desbordamiento al foso. Área de la cámara rellena incompletamente. Burbujas de aire en cualquier área de la cámara. Cualquier residuo en el área de la cámara.

Para obtener un coeficiente de variación del 5%, es necesario contar unas 400 células (tabla 27.1); en la práctica, es razonable contar 100 glóbulos blancos. Para minimizar los errores de distribución, contar las células en el área rayada completa (es decir, áreas de 9 × 0,1 μl en una cámara de recuento de Neubauer mejorada).

Cálculo Recuento leucocitario por litro (RL/l) 6 = N.º de células contadas × dilución × 10 Volumen contado (μl)

Así, si se cuentan N células en 0,1 μl, entonces el RL/l es como sigue:

579

580

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tabla 27.1.

Varianza del recuento hemático

N. de áreas

N.o total de células contadas

√

σ

Incertidumbre del total de células contadas

Intervalo por área 1 mm2

Recuento calculado/μl

1

50

7

14

36–64

36–64

7,2–12,8

2

100

10

20

80–120

40–60

8,0–12,0

4

200

14

28

172–228

43–57

8,6–11,4

6

300

17

34

266–334

44–56

8,9–11,1

8

400

20

40

360–440

45–55

9,0–11,0

10

500

22

44

456–544

46–54

9,2–10,8

16

800

28

56

744–856

47–53

9,4–10,6

20

1.000

32

64

936–1.064

47–53

9,4–10,6

30

1.500

39

78

1.422–1.578

47–52

9,4–10,4

200

10.000

100

200

9.800–10.200

49–51

9,8–10,2

o

El error inherente del resultado de un recuento celular resulta del modo aleatorio en que las células se distribuyen en la cámara de recuento. Esto se conoce como la varianza del recuento (σ); se calcula como √n ÷ n, donde n = número de células contadas realmente y la varianza se expresa como porcentaje. La incertidumbre del recuento está en el intervalo n ± σ. En este ejemplo teórico, el recuento final (calculado) se basa en el número de células en un área de 1 mm2 a una dilución de 1:20. Había aproximadamente 50 células en cada área de 1 mm2. Por comodidad, los resultados se han redondeado al número entero más cercano. Contar sólo uno o dos campos produce una amplia varianza que se reduce cuantas más células se cuentan. Sin embargo, se consigue alta precisión sólo cuando se cuentan miles de células, lo que sólo es posible con contadores celulares automáticos.

N × 20 × 106 = N × 200 × 106 0,1 (p. ej., si se cuentan 115 células, el RL es 115 × 200 × 106/l = 23 × 109/l).

Intervalos de recuento leucocitario en personas sanas Véanse las páginas 14 a 16.

Recuento plaquetario En los laboratorios de escasos recursos, los recuentos manuales se utilizan rutinariamente con muestras de sangre que contienen una proporción significativa de plaquetas gigantes, lo que es necesario incluso en los laboratorios bien equipados. Sin embargo, para el resto de las muestras los aparatos de recuento automáticos de sangre completa consiguen recuentos plaquetarios con una precisión mucho más elevada que con el método manual de recuento de plaquetas. Los recuentos plaquetarios se realizan mejor en sangre anticoagulada con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) obtenida mediante venopunción. También se pueden llevar a cabo con sangre obtenida mediante pinchazo cutáneo, pero los resultados son menos satisfactorios que los de sangre venosa. El recuento plaquetario por punción cutánea es significativamente más bajo que el recuento de sangre venosa y menos constante17; probablemente, en el punto de punción de la piel se pierden un número variable de plaquetas. Los recuentos plaquetarios manuales se realizan por examen visual de sangre completa diluida y lisada median-

te una cámara de recuento de Neubauer o de Neubauer mejorada igual que para el recuento leucocitario total18,19.

Método El diluyente consiste en oxalato de amonio acuoso al 1% en el que se lisan los glóbulos rojos. Se recomienda este método, en comparación con el que usa citrato como diluyente, que deja los glóbulos rojos intactos y es más probable que dé resultados incorrectos cuando el recuento plaquetario es bajo. Antes de diluir la sangre, examinarla cuidadosamente para detectar la presencia de coágulos de sangre. Si existen, debería solicitarse una muestra reciente, porque los coágulos causarían un recuento plaquetario artificialmente bajo. Hacer una dilución 1:20 de sangre roja bien mezclada en el diluyente añadiendo 0,1 ml de sangre a 1,9 ml de diluyente de oxalato de amonio (10 g/l). No se debería preparar cada vez más de 500 ml de diluyente, y es conveniente usar un recipiente de cristal escrupulosamente limpio y agua fresca destilada o desionizada. Si es posible, la solución debería filtrarse a través de un filtro con microporos (0,22 μm) y mantener a 4 °C. Para usarlo, se vuelve a filtrar una pequeña parte de la solución madre y se dispensa en volúmenes de 1,9 ml en tubos de 75 × 12 mm. Mezclar la suspensión en un mezclador mecánico durante 10-15 min. Rellenar una cámara de recuento de Neubauer con la suspensión, usando un capilar de cristal fuerte o una pipeta de Pasteur. Colocar la cámara de recuento en una placa de Petri húmeda y dejar en reposo durante al menos 20 min para dar tiempo a que las plaquetas se fijen.

27 Hematología en laboratorios de recursos escasos

Examinar la preparación con un objetivo ×40 y oculares ×6 o ×10. Las plaquetas, bajo iluminación ordinaria, aparecen como partículas pequeñas (pero no diminutas) altamente refractarias si se visualizan con el condensador cerrado; generalmente están bien separadas y son raros los grupos si la sangre ha sido recogida con habilidad. Para evitar la introducción en la cámara de partículas sucias, que podrían confundirse con las plaquetas, todo el equipo debe estar escrupulosamente limpio. Las plaquetas se ven más fácilmente con el microscopio de contraste de fase. Para un efecto de contraste de fase óptimo es mejor una cámara de recuento especial con el fondo fino (1 μm). Deberían contarse el número de plaquetas en una o más áreas de 1 mm2. El número total de plaquetas contado debería siempre ser mayor de 200 para asegurar un coeficiente de variación del 8-10%.

Cálculo Recuento de plaquetas por litro = N.º de células contadas × dilución × 106 Volumen contado (μl) Así, si N es el número de plaquetas contadas en un área de 1 mm2 (0,1 μl en volumen), el número de plaquetas por litro de sangre es: N × 10 × 20 (dilución) × 106 = N × 200 × 106

Intervalo de recuento plaquetario en personas sanas

Exactitud de las diluciones No se recomiendan las pipetas de dilución con bulbo, porque son difíciles de calibrar y se rompen fácilmente. Los volúmenes de sangre que emplean son innecesariamente pequeños y es difícil rellenar la cámara de recuento de manera que se libere la cantidad exacta. Las pipetas de 0,1 y 0,02 ml (20 μl) son relativamente baratas y fáciles de calibrar. Con un volumen de 2 ml en un tubo de cristal o plástico provisto de una goma que ajuste adecuadamente o un tapón de plástico, se obtiene una suspensión que es fácil de etiquetar y manejar, y con un poco de práctica se puede conseguir con regularidad un perfecto llenado de la cámara de recuento con la ayuda de una pipeta Pasteur de plástico fino o un tubo capilar de cristal fuerte. Son útiles las unidades de dilución automática. Éstas constan de un sistema de medida dual, que permite que el volumen del diluyente y el volumen de sangre apropiado se dispensen de manera consecutiva en un tubo (v. pág. 600). Actualmente están disponibles una gran variedad de sistemas de dilución automáticos, que tienen gran exactitud y precisión. Las micropipetas manuales semiautomáticas con punta desechable están diseñadas para funcionar como pipetas «para repartir», pero el suministro regular de las puntas desechables, puede ser demasiado caro y difícil de mantener para los laboratorios pobres. Los errores de pipeteo son aplicables a todas las pruebas que implican dilución de las muestras de sangre y también ocurre con dispensadores automáticos, que son propensos a errores con los líquidos viscosos y cuando el volumen liberado de la unidad no está correctamente ajustado.

Véanse páginas 14 a 16.

Artefactos microscópicos Errores en el recuento celular manual

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Los errores que se asocian con el recuento celular manual son técnicos e inherentes. Los errores técnicos pueden minimizarse evitando lo siguiente: • Técnica inadecuada para la obtención de la muestra de sangre. • Insuficiente mezclado de la muestra de sangre. • Pipeteo impreciso y uso de pipetas o cámaras de recuento mal calibradas. • Inadecuada mezcla de la suspensión celular. • Relleno defectuoso de la cámara de recuento. • Recuento poco cuidadoso de las células en la cámara.

Cámaras de recuento estandarizadas Para reducir los errores es importante tener unas cámaras de recuento de buena calidad. La profundidad exacta de la cámara depende también del cubreobjetos, que debería estar libre de inclinaciones y ser lo suficientemente grueso para no curvarse cuando se presione sobre la cámara. Debe estar sin arañazos e incluso la más pequeña partícula de polvo puede causar desequilibrio en la superficie de la cámara. Las especificaciones descritas por la OMS16 describen las dimensiones aceptables de las cámaras de recuento que proporcionan una precisión razonable.

Los detritus de los glóbulos rojos sucios o agregados pueden confundirse con glóbulos blancos o plaquetas. La agregación de los glóbulos blancos se produce particularmente en la sangre heparinizada, especialmente cuando la concentración de heparina excede las 25 UI/ml de sangre. Los agregados se ven con más frecuencia en la sangre que se ha mantenido vertical durante varias horas antes de emprender el recuento. Los errores inherentes resultan de una distribución irregular de las células en la cámara de recuento y ninguna cantidad de la mezcla minimizará esta inherente variación en el número entre las áreas. Los errores inherentes sólo se pueden reducir mediante el recuento de más células en una preparación. En teoría, el recuento varía en proporción a la raíz cuadrada del número de células contadas (es decir, si se cuenta cuatro veces el número de células, la variación se reduce a la mitad [v. tabla 27.1]). Por ejemplo, cuando se realiza un recuento manual leucocitario, el 95% de los recuentos observados en una muestra de valor real 5,0 × 109 células por litro estarían entre 4,0 y 6,0. En la práctica, la diferencia entre 5,0 y 6,0 × 109 células por litro en un recuento leucocitario es de poca significación clínica. Es también importante para el observador no cometer sesgos en el recuento por premoniciones del resultado que puede esperarse o por la selección de ciertas áreas en la cámara de recuento20.

581

582

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

solución salina tamponada (para preparación, v. pág. 588) para asegurar una elevada sensibilidad, con una aceptable especificidad22,23. Dado que la tasa de falsos positivos está alrededor del 10%, la confirmación de un resultado positivo requiere el envío de una muestra a un laboratorio capaz de cuantificar hemoglobina A2. La prueba puede usarse también para detectar rasgo talasémico α0, remitiendo las muestras positivas a un centro de referencia para análisis del ADN. Alrededor del 50% de las muestras con hemoglobina E también dan un resultado positivo; esto es una ventaja más que un inconveniente porque la detección de hemoglobina E es importante para la predicción de la posibilidad de talasemia mayor o intermedia en heterocigotos compuestos con β-talasemia. Figura 27.5. Aspectos de los glóbulos rojos en portaobjetos lavados con detergente.

Morfología de la sangre periférica El examen de un frotis de sangre periférica es de suma importancia. Además de proporcionar información sobre los cambios cuantitativos de los glóbulos rojos, el cuidadoso análisis de los cambios cualitativos puede ayudar a aclarar las razones subyacentes de problemas clínicos. Estas observaciones pueden permitir identificar la causa de la anemia o la fiebre no diagnosticada o la presencia de una hemoglobinopatía (v. cap. 5). Los problemas que pueden producirse durante la preparación de los frotis sanguíneos están relacionados con los portaobjetos en sí mismos y con la calidad de fijación del frotis y los reactivos usados para la tinción. Cuando existe un escaso suministro de portaobjetos, los laboratorios a veces tienen necesidad de lavarlos y reutilizarlos (v. pág. 592). Los restos de detergente, los residuos de colorantes y los arañazos en los portas pueden conducir a una apariencia errónea de los glóbulos rojos (fig. 27.5). En condiciones húmedas, particularmente durante la estación de lluvias, el agua puede ser absorbida por el metanol que se usa para fijar los portaobjetos y esto puede causar artefactos muy marcados en la apariencia de los glóbulos rojos (v. fig. 4.2, pág. 56). Para evitar este problema, las botellas de depósito de metanol deben dejarse muy bien cerradas después de su empleo; para uso diario deberían separarse alícuotas de pequeñas cantidades en botellas con una tapa que encaje perfectamente y reemplazarlas regularmente de la botella de depósito.

Prueba de fragilidad osmótica modificada (prueba de un tubo) Esta simple y barata prueba para la detección de rasgo talasémico β es útil cuando no es posible la cuantificación de hemoglobina A2 y no hay disponibles analizadores automáticos estandarizados para una medida precisa del VCM y la HCM21. Se han usado varias concentraciones de solución salina tamponada. Se recomienda una concentración de 0,36% en

Prueba de detección de la hemoglobina E Idealmente, el diagnóstico de hemoglobina E en heterocigosis u homocigosis debería hacerse mediante electroforesis de hemoglobina, a pH alcalino o con cromatografía líquida de alta resolución, empleando un segundo método para confirmar la identificación provisional (v. cap. 12). Cuando no se dispone de estos medios, puede emplearse una prueba de detección usando el azul de 2,6-diclorofenolindofenol (DCIP)g. Las muestras que contienen hemoglobina E se hacen ligeramente turbias cuando se incuban con DCIP24,25.

SERVICIOS DE LABORATORIO PARA EL MANEJO DE VIH/SIDA: RECUENTO DE CÉLULAS T CD4+ Las instalaciones para el recuento de CD4+ son esenciales en los países con una elevada incidencia de VIH/sida, tanto para el diagnóstico como para la identificación y el seguimiento de pacientes que se beneficiarían de fármacos antirretrovirales. Actualmente se dispone de un método que usa una simple plataforma de citometría de flujo individual, que resulta apropiado para los laboratorios de hospitales de distrito26 (www.guavatechnologies.com). Sin embargo, éste puede ser demasiado complejo de mantener y demasiado caro para instalaciones periféricas en algunos países de escasos recursos. Se ha descrito una técnica de análisis de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) en manchas de sangre secas para cuantificar linfocitos CD4+ fácil de usar sobre el terreno27. Sin embargo, no se ha confirmado todavía si este método es efectivo para muestras con recuentos bajos de CD4+. Se están desarrollando otros métodos, incluyendo sistemas de tiras reactivas que todavía requieren estudios de campo.

g

Para esta prueba existe un equipo adecuado disponible de PCL Holding Co. Ltd., Sirinthorn Road, Bangplad, Bangkok (Fax: 662 881 0989).

27 Hematología en laboratorios de recursos escasos

Formación del personal

GESTIÓN DEL LABORATORIO

Comunicación entre laboratorios Es necesaria una buena planificación de la logística de un servicio para facilitar el flujo de comunicación entre clínicas y laboratorios centrales y especialistas clínicos. Esto permite el envío sin retrasos, desde el laboratorio central a la periferia, de informes sobre las muestras recibidas de la periferia y consejos relevantes sobre diagnósticos y manejo del paciente. El principal retraso en el tiempo de respuesta tras la llegada (v. pág. 545) es el resultado de una entrega lenta de los informes tras la realización de la prueba. La instalación de faxes y correos electrónicos puede ayudar a eliminar este retraso, pero ambos dependen de una línea de comunicación fija y del suministro eléctrico, los cuales con frecuencia están ausentes en una clínica rural remota. Una solución potencial es el uso de un sistema de comunicación de datos digital inalámbrica tal como la red de datos para informes de laboratorio Global System of Mobile (GSM)28. En algunas poblaciones rurales de países de escasos recursos tienen acceso a comunicaciones inalámbricas que son relativamente bien mantenidas. El volumen de datos requeridos para informes de laboratorio basados en texto es extremadamente modesto y su transmisión es de bajo coste. Los recientes servicios de mensajes mejorados y multimedia también permiten comunicaciones bidireccionales de datos y preguntas sobre bases de datos remotas. Los informes de los resultados pueden incorporarse en el sistema de información del laboratorio principal o de forma individual para laboratorios independientes más pequeños.

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Transporte de muestras En el capítulo 1 se describe la necesidad de asegurar las condiciones apropiadas para la conservación de muestras tras su obtención y otros aspectos del transporte de muestras al laboratorio. Los problemas especiales del transporte de muestras desde clínicas remotas a laboratorios y centros de referencia requieren consideraciones adicionales. Los laboratorios periféricos con recursos relativamente buenos pueden ayudar al desarrollo de iniciativas rurales mediante la creación de oportunidades de empleo para ciclistas, motociclistas, taxistas, compañías de mensajería formales e informales e incluso proveedores de servicios de helicópteros. La localización de las clínicas se facilita si están disponibles las coordenadas del Sistema de Posicionamiento Global (GPS) de cada clínica29. Mediante el empleo de los sistemas de comunicación de datos digitales inalámbricos de que se dispone actualmenteh, los servicios de laboratorio de los países de escasos recursos pueden ser modelos para el sistema sanitario en su conjunto.

h MTN (www.mtn.co.za); Vodacom (www.vodacom.co.za/default.aspx); Exactmobile (www.exactmobile.com).

En los países más pobres, a menudo no existen sistemas para una supervisión regular del rendimiento individual en el laboratorio, y mucho personal no recibe formación profesional continuada (v. pág. 536). La evaluación estándar de la práctica debería continuar por el resto de la vida profesional del personal del laboratorio, para asegurar resultados de alta calidad. En países de escasos recursos, la formación puede proporcionarse en asociación con programas de salud vertical, tales como el control del VIH o la tuberculosis, pero a menudo se pasa por alto la necesidad de formación en técnicas hematológicas básicas, porque dichas pruebas, tales como la determinación de la hemoglobina y el recuento leucocitario, no están unidas habitualmente a enfermedades específicas y por ello no son susceptibles de incorporarse a programas verticales. Sin embargo, dado que la anemia es la enfermedad más prevalente en todo el mundo y a menudo es el primer signo de enfermedad subyacente, la importancia de una medida de hemoglobina fiable no puede ser sobreestimada. Así, la formación continuada debería incluir el rango completo de pruebas ofrecidas por el laboratorio y no sólo aquellas que se emplean para ayudar al diagnóstico de enfermedades específicas. Los individuos necesitan mantener su propio expediente de formación, quizás en forma de cuaderno, y tener sus logros y planes de formación regularmente revisados por sus directores de línea. Deberían mantenerse registros centrales de toda la formación, para propósitos de evaluación y para asegurar una distribución equitativa y apropiada de la formación entre los diferentes niveles del personal. La evaluación regular de la calidad de los resultados de los laboratorios individuales permitirá la identificación de problemas específicos y poner de manifiesto ante los equipos de gestión regional temas tales como fallos de los equipos, discontinuidad de los suministros e interrupciones de las comunicaciones. Además, esta evaluación de la calidad permitirá identificar necesidades de formación diferenciadas, permitiendo limitar los recursos de enseñanza para ser específicamente enfocados. Actualmente, gracias a un acuerdo entre las principales editoriales internacionales y la OMS, muchas revistas médicas y técnicas publican sus artículos completos en Internet, y se puede acceder a ellos sin cargo o con un descuento significativo en la mayoría de los países de escasos recursosi.

Interacción del personal clínico El uso clínico apropiado del laboratorio tiene un impacto directo sobre la relación coste-efectividad del servicio (v. pág. 576). Enfermeras, trabajadores en el campo de la salud y oficiales de salud pública, al igual que doctores pueden ser los responsables de llevar a cabo las pruebas de

i

www.who.int/hinari/en.

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

laboratorio. Muchas de estas personas tienen poca o ninguna formación sobre cómo solicitar la prueba apropiada, cómo proporcionar muestras oportunas y adecuadas y cómo usar los resultados para el máximo beneficio del paciente. La formación de los usuarios del laboratorio necesita incorporarse a los programas de formación del laboratorio y evaluarse con gran atención. En los países más pobres hay a menudo escasez de clínicos con experiencia tanto clínica como de laboratorio que estén cualificados para proporcionar dicha formación. En estas circunstancias pueden mejorarse las relaciones entre el laboratorio y el personal clínico y optimizarse el uso del laboratorio, mediante la utilización de equipos de clínicos y técnicos para que proporcionen formación mixta en ambas disciplinas.

Equipos de gestión de la salud A menudo, los equipos de gestión de la salud locales son responsables de asegurar que sus laboratorios estén provistos de las herramientas necesarias para proporcionar un servicio de alta calidad. Como regla, estos equipos no incluyen miembros de la profesión de técnicos de laboratorio, los cuales sólo están representados por otros profesionales afines, como farmacéuticos. De esta manera, el personal de los laboratorios de escasos recursos no siempre es responsable de la compra de suministros y equipos para el laboratorio, lo que resulta en pérdidas debidas a la compra de equipos y reactivos inapropiados o de escasa calidad. Además, para promover la adecuada representación de los profesionales de laboratorio en la gestión, es importante asegurar que el personal que no es de laboratorio, responsable de tomar decisiones sobre los laboratorios de escasos recursos, esté informado sobre las necesidades de su servicio de laboratorio.

Salud y seguridad En el capítulo 25 se describen detalles sobre el tema de la seguridad en el laboratorio. La conciencia sobre estos temas debería promoverse constantemente dentro de todos los laboratorios, y el ambiente de trabajo debe ser tan seguro como sea posible. Debería prepararse un «Código de práctica segura de laboratorio», asequible y relevante a las circunstancias locales. Debería incluir lo siguiente: • Evaluación del riesgo. Identificación de los peligros potenciales en el lugar de trabajo y el riesgo que suponen para los trabajadores individuales o los visitantes del laboratorio. • Educación en prácticas de trabajo seguras. • Seguimiento de la adherencia a las normas de salud y seguridad. • Informe e investigación rápidos de los accidentes de laboratorio. Las jeringas desechables (v. pág. 1) están previstas para un solo uso. No pueden esterilizarse y nunca deberían reutilizarse. De manera similar, las lancetas desechables para punciones cutáneas nunca deben reutilizarse. La

práctica de usar una única lanceta en varios pacientes consecutivos y limpiarla con alcohol entre cada uso es inaceptable. BIBLIOGRAFÍA 1. Faiz MA, Yunus EB, Rahman MR, et al 2002 Failure of national guidelines to diagnose uncomplicated malaria in Bangladesh. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 67:396-399. 2. Akpek G, Lee SM, Gagnon DR, et al 2001 Bone marrow aspiration, biopsy, and culture in the evaluation of HIV-infected patients for invasive mycobacteria and histoplasma infections. American Journal of Hematology 67:100-106. 3. Sherman GG, Galpin JS, Patel JM, et al 1999 CD4+ T cell enumeration in HIV infection with limited resources. Journal of Immunological Methods 222:209-217. 4. Glencross D, Scott LE, Jani IV, et al 2002 CD45-assisted PanLeucogating for accurate, cost-effective dual-platform CD4+ T-cell enumeration. Cytometry 50:69-77. 5. Glencross DK, Mendelow BV, Stevens WS 2003 Laboratory monitoring of HIV/AIDS in a resource-poor setting. South African Medical Journal 93:262-263. 6. Eden T 2002 Translation of cure for acute lymphoblastic leukaemia to all children. British Journal of Haematology 118:945-951. 7. Lewis SM, Bain BJ, Swirsky DM 2000 Bench-aid for morphological diagnosis of anaemia. WHO, Geneva. 8. Mundy C, Ngwira M, Kadawele G, et al 2000 Evaluation of microscope condition in Malawi. Transactions of the Royal Society of Medicine and Hygiene 94:583-584. 9. Opoku-Okrah C, Rumble R, Bedu-Addo G, et al 2000 Improving microscope quality is a good investment for under-resourced laboratories. Transactions of the Royal Society of Medicine and Hygiene 94:582. 10. World Health Organization 1998 Laboratory services for primary heath care: requirements for essential clinical laboratory tests. Document: LAB/98.1. WHO, Geneva. 11. Mundy CJF, Bates I et al 2003. The operation, quality and costs of a district hospital laboratory service Malawi. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 97:403-408. 12. Lewis SM, Stott GJ, Wynn KJ 1998 An inexpensive and reliable new haemoglobin colour scale for assessing anaemia. Journal of Clinical Pathology 51:21-24. 13. Timan IS, Tatsumi N, Aulia D, Wangsasaputra E 2004 Comparison of haemoglobinometry by WHO haemoglobin colour scale and copper sulphate against haemiglobincyanide reference method. Clinical and Laboratory Haematology 26:253-258. 14. Van den Broek NR, Ntonya C, Mhanga E, et al 1999 Diagnosing anaemia in pregnancy in rural clinics: assessing the potential of the haemoglobin colour scale. Bulletin of the World Health Organization 77:15-21. 15. Montresor A, Ramsan M, Khalfan N, et al 2003. Performance of the Haemoglobin Colour Scale in diagnosing severe and very severe anaemia. Tropical Medicine International Health 8:1-6. 16. World Health Organization 2000 Recommended methods for the visual determination of white blood cell count and platelet count. Document WHO/DIL/00.3. WHO, Geneva. 17. Brecher G, Schneiderman M, Cronkite EP 1953 The reprodu-

27 Hematología en laboratorios de recursos escasos

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Metodología práctica World Health Organization 1986 Methods recommended for essential clinical chemical and haematological tests for intermediate hospital laboratories. WHO/LAB/86.3. WHO, Geneva. Carter JY, Lema OE 1994 Practical laboratory manual for health centres in Eastern Africa. African Medical and Research Foundation, PO Box 31025, Nairobi, Kenya. World Health Organization 1995 Production of basic diagnostic laboratory reagents. WHO Regional Publications, Eastern Mediterranean Series No. 2. World Health Organization 2000 Manual of basic techniques (revised 2nd ed.). WHO Distribution and Sales, Geneva. Garantía de calidad World Health Organization 1992 Basics of quality assurance for intermediate and peripheral laboratories. WHO Regional Publications, Eastern Mediterranean Series No. 2. World Health Organization 1993 Quality assurance related to health laboratory technology. WHO, Geneva. World Health Organization 1995 Quality systems for medical laboratories: Guidelines for implementation and monitoring. WHO Regional Publications, Eastern Mediterranean Series No. 14. Lewis SM 1998 Quality Assurance in Haematology WHO Document: LAB/98.4. WHO, Geveva. Mantenimiento de prevención del equipo World Health Organization 1992 Calibration and maintenance of semi-automated haematology equipment: Document: LBS/92.8. WHO, Geneva. World Health Organization 1994 Maintenance and repair of laboratory, diagnostic imaging, and hospital equipment. WHO Distribution and Sales, Geneva. Prácticas para laboratorios Abbott FR 1992 Teaching for better learning: a guide for teachers of primary health care staff. WHO, Geneva. World Health Organization 1992 Technical training requirements: report of meeting on development of appropriate technology to support primary health care. WHO, Geneva. The WHO documents on this list are generally available, without charge, from the Department of Essential Health Technologies, WHO, 1211 Geneva 27 (Fax: +41 22 791 4836) or from the Internet sites (see Table 24.6, p. 635). Documents are also available from the regional offices: Eastern Mediterranean: PO Box 1517, Alexandria 21511, Egypt. Southeast Asia: World Health House, Indraprastha Estate, New Delhi, 110002, India. Other publications from WHO Distribution and Sales are available at reduced prices in developing countries. Recursos de material educativo y mantenimiento para laboratorios con escasos recursos Echo Joint Mission Hospital Equipment Board Ullswater Crescent, Coulsdon, Surrey, CR3 2HR, UK Tel: +44 (0) 208 660 2220; Fax: +44 (0) 208 668 0751; e-mail: [email protected] Developing Health Technology Bridge House, Worlington Road, Barton Mills, IP28 7DX, UK Tel: +44 (0) 1603 416058; Fax: +44 (0) 1603 416066; e-mail: [email protected] www.dht-online.co.uk

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tropical Health Technology PO Box 50, Fakenham, Norfolk, NR21 8XB Tel: +44 (0) 1328 855805; Fax: +44 (0) 1328 853799; e-mail: [email protected] Teaching Aids At Low Cost (TALC) PO Box 49, St Albans, Herts. AL1 5TX, UK Tel: +44 (0) 1727 853869; Fax: +44 (0) 1727 846852;

e-mail: [email protected] www.talcuk.org TALC Library/Resource Centre Institute of Child Health, 30 Guilford Street, London, WC1N 1EH, UK Tel: +44 (0) 207 242 9789, ext. 2424

28 Apéndices S. Mitchell Lewis Preparación de reactivos de uso común, anticoagulantes y soluciones conservantes Tampones Reactivos Valores y reactivos de referencia Preparación del material de cristal Limpieza de portaobjetos Limpieza de recipientes de cristal Tamaños de los tubos Velocidad de centrifugación Unidades de peso y medida de uso común en hematología

Agua Para la mayoría de las determinaciones, el agua destilada ya preparada o el agua desionizada resultan igualmente adecuadas. A lo largo del texto este concepto está implícito cuando nos referimos a «agua». Cuando se requiere agua bidestilada o agua destilada purificada, se indica especialmente, y también cuando resulta adecuada o está indicada el agua del grifo.

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Solución de ácido-citrato-dextrosa (ACD)—NIH-A 22 g 8g 25 g

Esterilizar la solución en autoclave a 121 °C durante 15 min. Su pH es 5,4. Para su uso, añadir 10 volúmenes de sangre a 1,5 volúmenes de la solución. Para su empleo en estudios de supervivencia de glóbulos rojos, véase la página 315.

Solución de ácido-citrato-dextrosa (solución de Alsever) Dextrosa (114 mmol/l) Citrato trisódico, dihidrato (27 mmol/l)

592

Pesos atómicos y concentraciones moleculares Dosis de radiación Procedimientos estadísticos Cálculos Análisis de diferencias mediante la prueba-t Análisis de la variación mediante el valor F ANOVA Pipetas automatizadas (mecánicas) Autodiluyentes Microscopio Mantenimiento rutinario del microscopio Sangre desfibrinada

Cloruro sódico (72 mmol/l) Agua hasta 1 litro

PREPARACIÓN DE REACTIVOS DE USO COMÚN, ANTICOAGULANTES Y SOLUCIONES CONSERVANTES

Citrato trisódico, dihidrato (75 mmol/l) Acido cítrico monohidrato (42 mmol/l) Dextrosa (139 mmol/l) Agua hasta 1 litro

587 588 590 591 592 592 592 592 592

20,5 g 8,0 g

593 593 594 594 595 595 595 595 600 600 601 602

4,2 g

Ajustar el pH a 6,1 con ácido cítrico (aproximadamente, 0,5 g) y seguidamente esterilizar la solución mediante filtración por microporo (0,22 μm) o en autoclave a 121 °C durante 15 min. Para su uso, añadir 4 volúmenes de sangre a 1 volumen de solución.

Solución de citrato-fosfato-dextrosa (CPD), pH 6,9 Citrato trisódico, dihidrato (102 mmol/l) Fosfato dihidrógeno sódico, monohidrato (1,08 mmol/l) Dextrosa (11 mmol/l) Agua hasta 1 litro

30 g 0,15 g 2g

Esterilizar la solución en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de enfriarse hasta 20 °C, debería tener un tinte marrón y su pH debería ser 6,9.

Solución de citrato-fosfato-dextrosa (CPD), pH 5,6-5,8 Citrato trisódico, dihidrato (89 mmol/l) Acido cítrico, monohidrato (17 mmol/l) Fosfato sódico de dihidrógeno, monohidrato (16 mmol/l) Dextrosa (142 mmol/l) Agua hasta 1 litro

26,30 g 3,27 g 2,22 g 25,50 g

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HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Esterilizar la solución en autoclave a 121 °C durante 15 min. Para su uso como conservante anticoagulante, añadir 7 volúmenes de sangre a 1 volumen de solución.

Solución salina

Solución de citrato-fosfato-dextrosa-adenina (CPD-A), pH 5,6-5,8

Citrato trisódico (Na3C6H5O7.2H2O), 109 mmol/l

Citrato trisódico, dihidrato (89 mmol/l) Acido cítrico, monohidrato (17 mmol/l) Fosfato sódico de dihidrógeno, monohidrato (16 mmol/l) Dextrosa (177 mmol/l) Adenina (2,04 mmol/l) Agua hasta 1 litro

26,30 g 3,27 g 2,22 g 31,8 g 0,275 g

Esterilizar la solución en autoclave a 121 °C durante 15 min. Para su uso como conservante anticoagulante, añadir 7 volúmenes de sangre a 1 volumen de solución.

Cloruro sódico (NaCl) (154 mmol/l) Agua hasta 1 l

9,0 g

Disolver 32 ga en 1 litro de agua. Distribuir volúmenes adecuados (p. ej., 10 ml) en frascos pequeños y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.

Heparina En el mercado se encuentra heparina en polvo (sal de litio) con una actividad de 160 UI/mg. Disolverla en agua a una concentración de 4 mg/ml. La heparina sódica se comercializa en ampollas de 5 ml con una actividad de 1.000 UI/ml. Añadir volúmenes apropiados de cada solución a una serie de envases y dejar secar a 20 °C para obtener una concentración que no exceda 15-20 UI/ml de sangre.

Solución de baja fuerza iónica (LISS)1 Cloruro sódico (NaCl) (30,8 mmol/l) Fosfato de hidrógeno disódico (Na2HPO4) (1,5 mmol/l) Fosfato dihidrógeno sódico (NaH2PO4) (1,5 mmol/l) Glicina (NH2CH2COOH) (240 mmol/l) Agua hasta 1 litro

1,8 g

TAMPONES

0,21 g

Tampón barbital, pH 7,4

0,18 g 18,0 g

Dietilbarbiturato sódico (C8H11O3N2Na) (57 mmol/l) Ácido clorhídrico (HCl) (100 mmol/l)

11,74 g 430 ml

Solución salina tamponada con barbital, pH 7,4 Disolver el cloruro sódico y las dos sales de fosfato en unos 400 ml de agua; disolver la glicina por separado en unos 400 ml de agua, ajustar el pH de cada solución hasta 6,7 con NaOH 1 mol/l. Mezclar las dos soluciones y completar hasta un litro. Esterilizar mediante filtros Seitz o autoclave. El pH debería estar entre 6,65 y 6,85, la osmolaridad entre 270 y 285 mmol y la conductividad entre 3,5 y 3,8 mS/cm a 23 °C.

EDTA Sal dipotásica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) Agua hasta 1 litro

100 g

Dejar secar en frascos a 20 °C volúmenes apropiados para conseguir una concentración de 1,5 ± 0,25 mg/ml de sangre.

EDTA neutro, pH 7,0, 110 mmol/l Sal dipotásica de EDTA o sal disódica NaOH 1 mmol/l Agua hasta 1 litro

44,5 g 41,0 g 75 ml

5,67 g 1l

Antes de usar, diluir con un volumen igual de NaCl a 9 g/l.

Solución salina tamponada con barbital, pH 9,5 Dietilbarbiturato sódico (C8H11O3N2Na) (98 mmol/l) Ácido clorhídrico (HCl) (100 mmol/l) NaCl

20,2 g 20 ml 5,67 g

Antes de usar, diluir el tampón con un volumen igual de NaCl a 9 g/l.

Tampón de albúmina sérica bovina y barbital, pH 9,8 Dietilbarbiturato sódico (C8H11O3N2Na) (54 mmol/l) NaCl (102 mmol/l) Azida sódica (31 mmol/l) Albúmina sérica bovina (BSA) Agua hasta 1 litro

10,3 6,0 2,0 5,0

g g g g

Disolver los reactivos en unos 900 ml de agua. Ajustar el pH a 9,8 con HCl 5 mol/l. Completar hasta 1 l con agua. Mantener a 4 °C.

EDTA tamponado neutro, pH 7,0 Sal disódica de EDTA (9 mmol/l) Fosfato hidrógeno disódico (Na2HPO4) (26,4 mmol/l) Cloruro sódico (NaCl) (140 mmol/l) Agua hasta 1 litro

NaCl Tampón barbital, pH 7,4

3,35 g

Tampón de citrato solución salina 3,75 g 8,18 g

Citrato trisódico (Na3C6HO7. 2H2O) (5 mmol/l)

a

O bien 38 g de 2Na3C6H5O7.11H2O.

1,5 g

28 Apéndices

NaCl (96 mmol/l) Tampón barbital, pH 7,4 Agua

5,6 g 200 ml 800 ml

Tampón glicina, pH 3,0 6,15 g 4,80 g 820 ml 180 ml

Tampón HEPES, pH 6,6 N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2- ácido etanosulfónico (100 mmol/l) 23,83 g Disolver en unos 100 ml de agua. Añadir un volumen suficiente de NaOH 1 mol/l (c 1 ml) para ajustar el pH a 6,6. Si se tiene previsto usar el tampón con la tinción de Romanowsky (v. pág. 54), añadir 25 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Completar hasta un volumen de 1 litro con agua.

Tampón HEPES-solución salina, pH 7,6 HEPES (20 mmol/l) NaCl

4,76 g 8,0 g

Disolver en unos 100 ml de agua. Añadir el volumen suficiente de NaOH 1 mol/l para ajustar el pH a 7,6. Completar hasta un volumen de 1 litro con agua.

Solución salina tamponada con imidazol, pH 7,4 3,4 g 5,85 g

Disolver en unos 500 ml de agua. Añadir 18,6 ml de HCl 1 mol/l y completar hasta un volumen de 1 litro con agua. Mantener a temperatura ambiente (18-25 °C).

© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

pH 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,7

Solución A 87 ml 83 ml 75 ml 66 ml 56 ml 46 ml 32 ml 24 ml 18 ml 13 ml 9,5 ml

Soluciones de partida:

(A) KH2PO4 (B) Na2HPO4 o Na2HPO4.2H2O

66 mmol/l 9,1 g/l 9,5 g/l 11,9 g/l

100 mmol/l 13,8 g/l 14,4 g/l 18,0 g/l

23,4 g/l 21,3 g/l Solución B 13 ml 17 ml 25 ml 34 ml 44 ml 54 ml 68 ml 76 ml 82 ml 87 ml 90,5 ml

El suero humano normal tiene una osmolalidad de 289 ± 4 mmol. Hendry2 recomendaba concentraciones ligeramente diferentes de la solución madre, a saber, 25,05 g/l de NaH2PO4.2H2O y 17,92 g/l de Na2HPO4 para un tampón isoosmótico.

150 mmol/l 20,7 g/l 21,6 g/l 27,1 g/l

Para obtener una solución con el pH requerido, añadir A y B en las proporciones indicadas: pH 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0

A 97,0 95,0 92,2 88,0 81,0 73,0 63,0 50,8 38,9 28,0 19,2 13,0 8,5 5,5

B 3,0 5,0 7,8 12,0 19,0 27,0 37,0 49,2 61,1 72,0 80,8 87,0 91,5 94,5

Este tampón no es isoosmótico con el plasma normal (v. anteriormente).

Tampón Tris–HCl (200 mmol/l) Tris(hidroximetil)aminometano (24,23 g/l)

Tampón fosfato, isoosmótico (A) NaH2PO4.2H2O (150 mmol/l) (B) NaH2PO4 (150 mmol/l)

Volúmenes iguales de tampón fosfato isoosmótico y NaCl 9 g/l.

Tampón fosfato de Sörensen

Glicina (NH2CH2COOH) (82 mmol/l) NaCl (82 mmol/l) Agua HCl 0,1 mol/l

Imidazol (50 mmol/l) NaCl (100 mmol/l)

Solución salina tamponada con fosfato (PBS)

250 ml

Para obtener una solución con el pH requerido, añadir el volumen apropiado de HCl 1 mol/l y completar el volumen hasta 1 l con agua. pH 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0

Volumen 44,5 ml 42,0 ml 39,0 ml 33,5 ml 28,0 ml 23,0 ml 17,5 ml 13,0 ml 9,0 ml 5,0 ml

Las soluciones madre de 100 mmol/l, 150 mmol/l, 300 mmol/l y 750 mmol/l s pueden prepararse de manera similar con una apropiada cantidad de Tris y volumen de ácido.

589

590

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tampón Tris–HCl albúmina sérica bovina (BSA), pH 7,6, 20 mmol/l Tris-(hidroximetil)aminometano (20 mmol/l) EDTA, sal disódica (10 mmol/l) NaCl (100 mmol/l) Azida sódica (3 mmol/l)

2,42 3,72 5,85 0,2

g g g g

Disolver los reactivos en unos 800 ml de agua. Ajustar el pH a 7,6 con 10 mol/l de HCl. Añadir 10 g de BSA y completar hasta 1 l con agua.

Acetona formalina tamponada Disolver 20 mg de Na2HPO2 y 100 mg KH2PO4 en 30 ml de agua destilada. Añadir 45 ml de acetona y 25 ml de formalina al 40%. Mezclar bien y conservar a 4 °C. Usar en frío. Preparar un nuevo fijador cada 4 semanas.

REACTIVOS

Tromboplastina de cerebro de conejo En la actualidad se comercializa tromboplastina de cerebro de conejo desecada y congelada con una caducidad de 2-5 años o mayor. Normalmente está calibrada contra la preparación de tromboplastina de referencia internacional de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y se suministra con un Índice de Sensibilidad Internacional (ISI) y una tabla para convertir los tiempos de protrombina a Índice Internacional Normalizado (INR). Si no se dispone de un preparado comercial, es posible preparar un sustituto doméstico empleando cerebro de conejo que no requiere desecado y congelado y que es relativamente estable.

Cerebro en polvo desecado con acetona Quitar la membrana del cerebro de conejo obtenido recientemente, lavar para dejar limpio de sangre y colocar en acetona fría en una cantidad aproximada de tres veces su volumen. Macerar durante 2-3 min y entonces filtrar a través de un apósito absorbente (calidad BP o USP) en un embudo de Büchner. Repetir la extracción siete veces; después de dos extracciones, incrementar el tiempo de exposición a acetona en 20 min para cada extracción consecutiva. El material debería hacerse «arenoso» en la cuarta o quinta extracción. Después de la última extracción, extender el cerebro secado con acetona sobre un trozo de papel y dejar secar al aire durante 30 min. Frotar contra un tamiz con malla de nailon de 1 mm para conseguir un polvo grueso. Dispensar en un lote de frascos con tapón de rosca y secar con pentóxido de fósforo con un desecador de vacío. Tras el secado enroscar las tapas con fuerza y conservar a 4 °C o –20 °C. A –20 °C, el material debería mantenerse estable al menos 5 años. Con 100 g de cerebro completo se consiguen 15 g de polvo seco.

Preparación de suspensiones líquidas Disolver 0,9 g de NaCl y 0,9 g de fenol en 100 ml de agua. Suspender 3,6 g de cerebro desecado con acetona en

100 ml de la solución de solución salina-fenol a 15-20 °C y dejar reposar a esta temperatura durante 4-5 h, mezclando cada 30 min. Dejar en una nevera a 4 °C durante 24 h, mezclándolo ocasionalmente. A partir de entonces, dejar sin mover a 4 °C durante 3 h y seguidamente decantar cuidadosamente el sobrenadante a través de una muselina fina u otro material similar. El ISI no debería superar 1,4 (v. pág. 400), y el tiempo medio normal de protrombina debería ser 12-13 s. Conservar la suspensión a 4 °C. A esta temperatura permanecerá estable al menos 6 meses; a temperatura ambiente estará estable al menos 7 días. No debe congelarse, porque la congelación produce floculación de la suspensión con deterioro de la actividad de tromboplastina.

Reactivo fosfolipídico TTPA El cerebro de ratón desecado con acetona es útil para preparar un reactivo TTPA (tiempo de tromboplastina parcial activado). También se puede usar cerebro de bovino. Preparar el polvo de cerebro desecado con acetona como se describe anteriormente. Suspender 5 g del polvo en 20 ml de cloroformo (calidad analítica) en un vaso de precipitación cubierto, durante 1-2 h. Filtrar a través de papel de filtro para obtener un filtrado claro. Lavar el depósito de cerebro del papel de filtro con 20 ml de cloroformo y mezclar el filtrado obtenido con el filtrado anterior. Evaporar el filtrado para desecarlo en un vaso de precipitación de peso conocido en un baño de agua a 60-70 °C y pesar el sedimento residual: 5 g de cerebro desecado deberían producir 1,5 g de sedimento fosfolipídico. Emulsionar en solución salina para conseguir una emulsión al 5%; de 1,5 g de sedimento deberían obtenerse 30 ml de emulsión. Distribuir la emulsión en pequeños volúmenes en tubos con tapón. A –20 °C debería permanecer estable al menos un año. Para su uso, diluir 1:100 en solución salina y mezclar con volúmenes iguales de suspensión de caolín en tampón de imidazol.

Suspensión de riñón de cobaya Retirar la cápsula y la grasa perirrenal de al menos dos pares de riñones. Seguidamente lavarlos bien con agua bajo el grifo. Homogeneizar el tejido en NaCl 9 g/l (solución salina) en una batidora durante 2 min, esterilizar a 121 °C (con autoclave a una presión de 6,8 kg durante 20 min) y batir de nuevo hasta obtener una suspensión fina. A continuación, centrifugar la suspensión en solución salina y lavar el sedimento con dos cambios de solución salina. Finalmente, añadir al sedimento unas cuatro veces su volumen, de 5 g/l de fenol en solución salina. Después de resuspender, centrifugar la muestra en un tubo de hematocrito para calcular su concentración. Entonces añadir suficiente fenol-solución salina al resto para producir una suspensión 1:6. Utilizarlo sin diluir más. Debe analizarse su poder absorbente con sueros positivos o negativos conocidos. Los reactivos mantienen su potencia durante al menos 1 año si se conservan a 4 °C.

28 Apéndices

Suspensión de hematíes de buey Lavar las células de buey, en varios cambios de NaCl, 9 g/l (solución salina) y preparar una suspensión al 30%. Seguidamente esterilizarla a 121 °C (con el autoclave a una presión de 6,8 kg durante 20 min). Cuando se enfríe, ajustar el hematocrito a 0,20 con solución salina y añadir un volumen igual de solución salina-fenol 10 g/l para conseguir una suspensión al 10%. La capacidad de la suspensión para absorber los anticuerpos de la mononucleosis infecciosa debe analizarse con sueros positivos conocidos. Si se conserva a 4 °C debería mantener su potencia durante varios años.

VALORES Y REACTIVOS DE REFERENCIA La OMS ha establecido un amplio rango de materiales de referencia internacionales que son controlados por instituciones designadas. La mayoría de los materiales de interés hematológico enumerados abajo son controlados por el National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Los que están marcados con un asterisco son controlados por el International Laboratory for Biological Standards de la OMS, Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service (CLB). En la página web de la OMS (www.who.int/bloodproducts/catalogue/en/index.html) está disponible un catálogo y también pueden encontrarse detalles en la página web de la NIBSC (www.nibsc.ac.uk/products/catalogue.html).

Hematología general • • • • • • • • •

Eritropoyetina humana urinaria. Eritropoyetina recombinante derivada de ADN. Ferritina humana recombinante. Cianometahemoglobina. HbA2. HbF. Folato en sangre total. Proteína C reactiva (PCR). Proteínas séricas humanas mediante inmunoensayo: incluyendo transferrina*.

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Inmunohematología • Antisuero anti-A para tipificación de grupo sanguíneo*. • Antisuero anti-B para tipificación de grupo sanguíneo*. • Antisuero anti-D (anti-Rh0) incompleto para tipificación de grupo sanguíneo*. • Antisuero anti-D (anti-Rh0) completo para tipificación de grupo sanguíneo*. • Antisuero anti-E completo para tipificación de grupo sanguíneo*.

• Peroxidasa de rábano conjugada con IgG de oveja antiIgG humana*. • Componentes del complemento séricos humanos C1q, C4, C5, factor B y la actividad funcional CH50*.

Coagulación • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Ancrod. Antitrombina plasmática. Concentrado de antitrombina. Factores II, VII, IX, X (combinados como concentrados). Factor VIII y factor de Von Willebrand plasmáticos. Concentrado factor VIII. Concentrado factor IXa. Heparina de bajo peso molecular. Fibrinógeno plasmático. Plasmina. Activador-inhibidor del plasminógeno. Activador tisular del plasminógeno recombinante. Estreptocinasa. α-trombina. β-tromboglobulina. Antígeno plaquetario antihumano-1a. Factor plaquetario 4. Proteína S plasmática. Proteína C plasmática. Protamina. Urocinasa de alto peso molecular. Tromboplastina bovina combinada*. Tromboplastina humana recombinante*. Tromboplastina de conejo pura*. Concentrado de factor de Von Willebrand. Factor de Von Willebrand: Ag (antígeno); RCO (actividad del cofactor de la ristocetina); CB (actividad fijadora del colágeno).

La Unión Europea ha establecido los siguientes materiales certificados de referencia (BCR): • Cianometahemoglobina. • Tamaño de las partículas de látex: CRM165: 2,2 mm (5,7 fl); CRM166: 4,8 mm (60,0 fl); CRM167: 9,5 mm de diámetro. • Tromboplastina bovina (CRM148). • Tromboplastina de conejo pura (CRM149). • Proteínas séricas humanas (CRM470), incluyendo haptoglobina.

Direcciones de contacto

Inmunología

National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) Blanche Lane, South Mimms, Herts EN6 3QH, Inglaterra. Tel: 44 1707 646399 Fax: 44 1707 646977 Correo electrónico: [email protected]

• Inmunoglobulinas séricas humanas, inmunoglobulina G (IgG), IgA e IgM. • Inmunoglobulina IgE sérica humana. • Factor antinuclear, homogéneo*.

Central Laboratory of Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service (CLB) 125 Plesmanlaan, 1066 AD Amsterdam, Países Bajos

591

592

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tel: 31 20 512 9222 Fax: 31 20 512 3252 European Union (BCR) Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) Retieseweg B2440, Geel, Bélgica Fax: 32 14 590 406 Correo electrónico: [email protected]

PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE CRISTAL

Recipientes de cristal siliconados Utilizar una solución de silicona al 2% (dimetildiclorosilano) en solvente. Sumergir el recipiente de cristal limpio o las jeringas que se quieran recubrir en el líquido y dejar escurrir hasta que se sequen. (Deberían usarse guantes de goma y el procedimiento debería hacerse en una campana de humos con extractor.) Seguidamente, aclarar minuciosamente con agua el recipiente de cristal recubierto y dejar secar en un horno a 100 °C durante 10 min o durante la noche en un incubador.

Limpieza de portaobjetos Portaobjetos nuevos Se comercializan varias marcas de portaobjetos libres de grasa. Si no se dispusiera de ellas, debe realizarse el siguiente procedimiento. Dejar los portaobjetos durante la noche en una solución de detergente. Seguidamente, lavar bien bajo agua del grifo, aclarar con agua destilada o desionizada y conservar en etanol o metanol al 95% hasta su uso. Secar con un paño de lino limpio y quitar el polvo cuidadosamente antes de su uso.

Portaobjetos sucios Cuando se desechen, colocarlos en una solución de detergente; calentar a 60 °C durante 20 min; y lavar bajo el grifo con agua caliente. Finalmente, aclarar con agua antes de secar con un paño de lino limpio.

Limpieza de recipientes de cristal Lavar con agua del grifo. Seguidamente hervir en una solución de detergente; aclarar en ácido, y lavar bajo el grifo con agua caliente, como se describe arriba. Alternativamente, el equipo puede sumergirse en HCl 3 mol/l. Para eliminar los restos de proteínas y otras materias orgánicas, se recomiendan detergentes «biodegradables». Es adecuado el Decon 90 (Decon Laboratories Ltd, Hove BN3 3LY, Reino Unido), pero también se dispone de varios preparados similares.

Recipientes de cristal libres de hierro Lavar en una solución de detergente; seguidamente, sumergir en HCl 3 mol/l durante 24 h; finalmente, aclarar en agua desionizada bidestilada.

TAMAÑOS DE LOS TUBOS Los tamaños de los tubos recomendados en el texto se han escogido por ser los apropiados para las pruebas descritas. Las dimensiones que se dan son la longitud y el diámetro externo (en mm). Algunos catálogos proporcionan el equivalente en pulgadas, y algunos de los diámetros internos correspondientes son los siguientes: 75 × 10 mm. (diámetro interno 8 mm) = 3 × 3/8 pulgadas. 75 × 12 mm. (diámetro interno 10 mm) = 3 × 1/2 pulgadas. 65 × 10 mm = 21/2 × 3/8 pulgadas. 38 × 6,4 mm = 11/2 × 1/4 pulgadas («tubos de precipitina»). 100 × 12 mm = 4 × 1/2 pulgadas. 150 × 16 mm = 6 × 5/8 pulgadas. 150 × 19 mm = 6 × 3/4 pulgadas.

VELOCIDAD DE CENTRIFUGACIÓN En todo el libro, la unidad empleada es la fuerza centrífuga relativa (g). La conversión de esta cifra a rpm (revoluciones/min) depende del radio de la centrífuga; puede calcularse empleando el nomograma ilustrado en la figura 28.1 o con la fórmula para la fuerza centrifuga relativa (FCR): FCR = 118 × 10–7 × r × N–2 donde r = radio (cm) y N = velocidad de rotación (rpm). Se recomiendan las siguientes fuerzas centrífugas: «Bajo centrifugado» plasma rico en plaquetas 150-200 g (durante 10-15 min) «Alto centrifugado» plasma 1.200-1.500 g (durante 15 min) Hematocrito 2.000-2.300 g (durante 30 min)

UNIDADES DE PESO Y MEDIDA DE USO COMÚN EN HEMATOLOGÍA A lo largo del libro las medidas se han expresado en unidades del SI, de acuerdo con las recomendaciones universales3. Estas unidades derivan del sistema métrico. A continuación se muestran las unidades básicas y las formas abreviadas se indican a su lado.

Peso-unidad: gramo (g)

× 103 = kilogramo (kg) × 10–3 = miligramo (mg) ×10–6 = microgramo (μg) × 10–9 = nanogramo (ng) × 10–12 = picogramo (pg) × 10-15 = fentogramo (fg)

28 Apéndices

rpm 25.000 20.000

cm

pulgada

50

20 18

15.000

10.000

40

g

14

30.000 20.000 6.000

16

30

12

10.000 10

4.000 3.000

5.000 9 2.000

20 18

1.000

8 7

16

2.000

6

500 14 200 1.000

12

5

100 10

4

50 500

20

8 3

Concentración de una sustancia – unidad: moles por litro (mol/l) (previamente M) × 10–3 = milimoles por litro (mmol/l) × 10–6 = micromoles por litro (μmol/l)

Concentración de masa–unidad: gramos por litro (g/l)

× 10–3 = miligramos por litro (mg/l) × 10–6 = microgramos por litro (μg/l) Cuando se prepara una cantidad pequeña de un reactivo, es más apropiado expresar su concentración por ml o dl. Para convertir una medida de concentración de masa a concentración molar, se divide por la masa molecular. Así, por ejemplo, la masa molecular de la Hb humana (como tetrámero 4Fe) es 64.458 (v. pág. 25) o 16.114 como monómero Fe. Por ello cuando la Hb es 160 g/l, esto equivale a 160 ÷ 16,114 mol/l (es decir, 9,9 mmol/l).

PESOS ATÓMICOS Y CONCENTRACIONES MOLECULARES La concentración de una sustancia en solución puede expresarse tanto en g/l como en mol/l. La última se indica también mediante M (p. ej., HCl 0,1 M = 0,1 mol/l). Un mol (mol) es el peso molecular o la masa molecular relativa (MMR) de la sustancia (incluyendo el agua de cristalización si está presente). Así, por ejemplo: MMR de NaCl = 58,5; entonces 1 mol/l = 58,5 g/l y 9 g/l= 9 ÷ 58,5= 0,154 mol/l = 154 mmol/l

10

Los pesos atómicos de algunos compuestos químicos de uso común en la preparación de reactivos son los siguientes:

6 3 200

Figura 28.1. relativas.

2

Nomograma para calcular las fuerzas centrífugas

© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

Longitud – unidad: metro (m)

× × × × ×

10–1 10–2 10–3 10–6 10–9

= = = = =

decímetro (dm) centímetro (cm) milímetro (mm) micrómetro (μm) nanómetro (nm)

Volumen – unidad: litro (l o L) = dm3

× × × × × ×

10–1 = decilitro (dl) (previamente 100 ml) 10–3 = mililitro (ml) = cm3 (previamente cc) 10–6 microlitro (μl) = mm3 10–9 = nanolitro (nl) 10–12 = picolitro (pl) 10–15 fentolitro (fl)

Cantidad de sustancia – unidad: mol (mol) × 10–3 = milimol (mmol) × 10–6 = micromol (μmol)

Calcio Carbono Cloro Cromo Hidrógeno Hierro Magnesio Nitrógeno Oxígeno Fósforo Potasio Sodio Azufre

40 12 35 52 1 56 24 14 16 31 39 23 32

DOSIS DE RADIACIÓN Cuando se emplean radioisótopos, debe tenerse en cuenta su riesgo potencial para el receptor y los trabajadores del laboratorio. El grado de riesgo de la radiación, en relación con las pequeñas cantidades de radioisótopos empleados en las pruebas diagnósticas, depende de un número de factores, a saber: la energía y el rango de las radiaciones; si

593

594

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

el radioisótopo está ampliamente distribuido en el cuerpo o si se localiza en órganos específicos, la semivida física de los radioisótopos, y su semivida biológica en el cuerpo. Antiguamente, la radioactividad se expresaba en curies (Ci); 10–3 Ci = 1 mCi y 10–6 = 1 μCi. La unidad de radiactividad del SI preferida es el Becquerel (Bq). 1 Bq corresponde a una desintegración por segundo, así que 1 Ci = 3,7 × 1010 Bq, 1 milicurie (mCi) = 3,7 × 107 Bq o 37 megabecquerels (MBq) y 1 microcurie (μCi) = 3,7 × 104 Bq o 0,037 MBq; 103 MBq = 1 gigabecquerel (GBq). El efecto de la radiación sobre el cuerpo depende, esencialmente, de la cantidad de energía depositada. Esto se expresa en grays (Gy); 1 Gy es la dosis de radiación que deposita un julio de energía por kg de tejido. En el pasado, esto se expresaba en rads (1 Gy = 100 rad). La reacción del cuerpo a la radiación también depende del tipo de la radiación iónica particular. Los efectos biológicos de la radiación se calculan a partir de la cantidad de Gy (o rad) multiplicada por un factor de calidad ionizante; este factor varía con el tipo de radiación y es veinte veces mayor para rayos-α que para rayos-β o rayos-γ. La unidad para describir el efecto biológico de la radiación (es decir, la unidad de «dosis efectiva») es el Sievert (Sv). La dosis anual límite para el cuerpo completo para alguien que trabaja con radioisótopos es 50 mSv, con una cantidad mayor para órganos individuales. A las personas que no forman parte del personal sanitario se les aplican límites de dosis más bajas, de 5mSv.

cuando se hace un recuento de glóbulos rojos en una suspensión diluida. El número de células contadas en un volumen dado variará en cada ocasión; esta variación en el recuento (σ) es 0,92 λ, donde λ = número total de células contadas (v. pág. 581). Esto es una estimación de la desviación estándar en la población completa, mientras que DE indica la desviación estándar de las variables que se han medido realmente. El coeficiente de variación (CV) es otro modo de indicar la desviación estándar, relativo a las medidas reales, de manera que puedan compararse las variaciones a diferentes niveles. Se expresa como un porcentaje. El error estándar de la media (EEM) es una medida de dispersión de la media de un conjunto de medidas. Se usa para comparar medias de dos conjuntos de datos.

Cálculos Varianza (s2)

–)2 Σ(x – x n–1

Desviación estándar (DE) s2

Coeficiente de variación (CV) como porcentaje DE × 100% – x

PROCEDIMIENTOS ESTADÍSTICOS

Error estándar de la media (EEM) La media (x¯) es la suma de todas la medidas (Σ) dividido por el número de medidas (n). La mediana (m) es el punto de la escala que tiene un número igual de observaciones por encima y por debajo. La moda es el resultado más frecuente. La distribución de Gauss describe eventos o datos que ocurren simétricamente alrededor de la media (v. fig. 2.1, págs. 11-12); con este tipo de distribución, la media, la mediana y la moda son aproximadamente iguales. El grado de variación de las medidas alrededor de la media se expresa como la desviación estándar (DE). Su cálculo se describe más adelante. Esto quiere decir que el 68% de las medidas estarán en un rango de ±1 DE, el 95% estarán en ± 2 DE y el 99% estarán en ±3 DE. Los intervalos de confianza indican los límites superiores e inferiores entre los que se espera que se encuentre una proporción especificada de los resultados (p. ej., el 95%). La distribución normal logarítmica describe sucesos que son asimétricos (oblicuos), con un gran número de observaciones hacia el final. Por ello, la media estará más cerca del final; la media, la mediana y la moda pueden diferir la una de la otra. Para calcular la media geométrica y la DE de los logaritmos, los datos son primero transformados a sus logaritmos y después de calcular la media y la DE de los logaritmos, los resultados son reconvertidos a antilogaritmos. La distribución de Poisson describe eventos que ocurren aleatoriamente. Esto por ejemplo, puede ser el caso de

DE n

Desviación estándar de resultados pareados Σd2 2n donde d = diferencias entre medidas pareadas y n = número de medidas pareadas.

Desviación estándar de la media Central 50% (entre 25 y 75%) 1,35

Intervalo de confianza Decidir el intervalo de confianza requerido (p. ej., 95 o 99%). En la tabla de la prueba-t (v. pág. 596) encontrar el número con n–1 grados de libertad. Calcular la DE y el EEM como se describe arriba. De esta manera el intervalo de confianza estará entre x¯ – (t × EEM) y x¯ + (t × EEM). Cuando los datos originales no siguen la distribución de Gauss, convertirlos a sus logaritmos, usar estas cifras para todos los cálculos y convertir los resultados a sus antilogaritmos.

28 Apéndices

Análisis de diferencias mediante la prueba-t El análisis de las diferencias mediante la prueba-t es un método para comparar dos series de datos (p. ej., para evaluar la precisión de un nuevo método contra un método de referencia).

Comparar esta medida con los valores que aparecen en la tabla de distribución de la F al 95 o 99% para los grados de libertad apropiados. Si la suma calculada es mayor que la obtenida en la tabla, se puede concluir que hay una probabilidad del 95 (o 99%) de que las diferencias entre las series sean significativas y no sólo resultado del azar.

Cálculo Determinar la diferencia en cada par de pruebas (d) y la – media de las diferencias (d ). – – s2 (d – d )2 La varianza se obtiene de ;t=d÷ n n–1 Obtener el valor de la t, para los grados de libertad apropiados (es decir, n – 1), de la gráfica de la prueba-t (tabla 28.1). Expresar los resultados con el nivel de probabilidad (p) para el que no hay diferencias significativas entre las series de datos que se están comparando.

Análisis de la variación mediante el valor F El análisis de la variación por el valor F es un método que se utiliza para evaluar la precisión relativa de dos series de medidas.

Cálculo Determinar la varianza (s2) como se describe previamente para cada serie. Dado que el valor no debe ser menor de 1, emplear la varianza más alta en el numerador. Entonces, leer el valor en la gráfica para las dos series de datos (tabla 28.2), con una probabilidad del 95 o 99% (es decir, p = 0,05 o p = 0,01) para los grados de libertad apropiados (es decir, n – 1).

Interpretación Hay una diferencia significativa en la variación entre las dos series cuando el valor calculado es mayor que el valor leído en la gráfica.

ANOVA

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ANOVA es otro método que suma los análisis de la variación al cuadrado cuando compara dos series de datos (p. ej., dos métodos diferentes para hacer una prueba o los resultados de dos individuos A y B haciendo la misma prueba).

Número de medidas

Serie A n

Serie B n

Añadir todos los resultados de cada uno de las dos series

ΣA

ΣB

Elevar al cuadrado cada suma

(Σ A)2

(Σ B)2

Combinar las series y dividir por el número de mediciones: (Σ A)2 + (Σ B)2 n Restar el factor de corrección: (Σ A + Σ B)2 ÷ (n total de A + B)

PIPETAS AUTOMATIZADAS (MECÁNICAS) La precisión del pipeteo es un requisito esencial para todas las pruebas cuantitativas. Existen una variedad de pipetas manuales automáticas, muchas de las cuales incorporan una punta desechable con un mecanismo eyector, que permite a la persona que lo usa quitarlo sin contacto manual. Algunas pipetas tienen una capacidad fija; en otras se puede obtener un rango de volúmenes por medio de una rueda de ajuste, y el volumen liberado se puede ver en una pantalla digital. Debido a que los diseños son variados, deben seguirse cuidadosamente las instrucciones específicas del fabricante. Los siguientes puntos son comunes: 1. Usar siempre la punta especificada. 2. Nunca lavar ni reutilizar las puntas. 3. Asegurarse de que la punta esté firmemente ajustada a la pipeta. 4. Mantener la pipeta limpia de suciedad y grasa. 5. Mantener la pipeta siempre en posición vertical. 6. No dejar la pipeta de lado con líquido en la punta. 7. Dejar la pipeta en su base después de usarla. 8. Trabajar con un procedimiento lento, tranquilo y coherente, evitando las burbujas o la espuma. 9. Emplear el «pipeteo inverso» para el plasma, los fluidos de elevada viscosidad y/o volúmenes muy pequeños. Con el émbolo presionado hasta el fondo (2.º tope), introducir la punta profundamente bajo la superficie del fluido y liberar el botón del émbolo lentamente. Retirar la pipeta, limpiar cuidadosamente la punta con un papel; y entonces, con la punta contra la pared interior del recipiente receptor, liberar el contenido soltando el botón del émbolo hasta el 1.er tope. A continuación, desechar la punta con su contenido residual. 10. Para dilución de la sangre, rellenar y vaciar la punta con sangre 2-3 veces; entonces presionar el émbolo al 1.er tope. Con la punta profundamente bajo la superficie de la muestra, liberar el émbolo para rellenar la punta con sangre. Retirar la pipeta de la muestra, limpiar el exterior de la punta cuidadosamente con un papel, introducir la punta en el diluyente profundamente bajo la superficie y presionar el botón del émbolo repetidamente para rellenar y vaciar la punta hasta que la pared interior esté limpia. Entonces presionar el émbolo hasta el 2.º tope para vaciar la punta completamente. 11. A intervalos, evaluar la fiabilidad de la pipeta evaluando su exactitud y precisión.

595

596

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Table 28.1.

Valores críticos de la prueba-t % de nivel de probabilidad

gl

50 (0,5)

40 (0,4)

30 (0,3)

20 (0,2)

10 (0,1)

5 (0,05)

1 (0,01)

1

1,000

1,376

1,963

3,078

6,314

12,706

63,657

2

0,816

1,061

1,386

1,886

2,920

4,303

9,925

3

0,765

0,978

1,250

1,638

2,353

3,182

5,841

4

0,741

0,941

1,190

1,533

2,132

2,776

4,604

5

0,727

0,920

1,156

1,476

2,015

2,571

4,032

6

0,718

0,906

1,134

1,440

1,943

2,447

3,707

7

0,711

0,896

1,119

1,415

1,895

2,365

3,499

8

0,706

0,889

1,108

1,397

1,860

2,306

3,355

9

0,703

0,883

1,100

1,383

1,833

2,262

3,250

10

0,700

0,879

1,093

1,372

1,812

2,228

3,169

11

0,697

0,876

1,088

1,363

1,796

2,201

3,106

12

0,695

0,873

1,083

1,356

1,782

2,179

3,055

13

0,694

0,870

1,079

1,350

1,771

2,160

3,012

14

0,692

0,868

1,076

1,345

1,761

2,145

2,977

15

0,691

0,866

1,074

1,341

1,753

2,131

2,947

16

0,690

0,865

1,071

1,337

1,746

2,120

2,921

17

0,689

0,863

1,069

1,333

1,740

2,110

2,989

18

0,688

0,862

1,067

1,330

1,734

2,101

2,878

19

0,688

0,861

1,066

1,328

1,729

2,093

2,861

20

0,687

0,860

1,064

1,325

1,725

2,086

2,845

21

0,686

0,859

1,063

1,323

1,721

2,080

2,831

22

0,686

0,858

1,061

1,321

1,717

2,074

2,819

23

0,685

0,858

1,061

1,321

1,717

2,074

2,819

24

0,685

0,857

1,059

1,318

1,711

2,064

2,797

25

0,684

0,856

1,058

1,316

1,708

2,060

2,787

26

0,684

0,856

1,058

1,315

1,706

2,056

2,779

27

0,684

0,855

1,057

1,314

1,703

2,052

2,771

28

0,683

0,855

1,056

1,313

1,701

2,048

2,763

29

0,683

0,854

1,055

1,311

1,699

2,045

2,756

30

0,683

0,854

1,055

1,310

1,697

2,042

2,750

40

0,681

0,851

1,050

1,303

1,684

2,021

2,704

50

0,680

0,849

1,048

1,299

1,676

2,008

2,678

60

0,679

0,848

1,046

1,296

1,671

2,000

2,660

120

0,677

0,845

1,041

1,289

1,658

1,980

2,617

'

0,674

0,842

1,036

1,282

1,645

1,960

2,576

© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

Tabla 28.2.

Tablas de distribución de la F (a) probabilidad 99% (p = 0,01) gl Numerador

gl Numerador 1

2

1

4052

2

5

6

7

8

9

10

12

15

20

24

30

40

60

120

∞

4999,5 5403

5625

5764

5859

5928

5981

6022

6056

6106

6157

6209

6235

6261

6287

6313

6339

6366

98,50

99,00

99,17

99,25

99,30

99,33 99,36

99,37

99,39

99,40

99,42

99,43

99,45

99,46

99,47

99,47

99,48

99,49

99,50

3

34,12

30,82

29,46

28,71

28,24

27,91 27,67

27,49

27,35

27,23

27,05

26,87

26,69

26,60

26,50

26,41

26,32

26,22

26,13

4

21,20

18,00

16,69

15,98

15,52

15,21 14,98

14,80

14,66

14,55

14,37

14,20

14,02

13,93

13,84

13,75

13,65

13,56

13,46

5

16,26

13,27

12,06

11,39

10,97

10,67 10,46

10,29

10,16

10,05

9,89

9,72

9,55

9,47

9,38

9,29

9,20

9,11

9,02

6

13,75

10,92

9,78

9,15

8,75

8,47

8,26

8,10

7,98

7,87

7,72

7,56

7,40

7,31

7,23

7,14

7,06

6,97

6,88

7

12,25

9,55

8,45

7,85

7,46

7,19

6,99

6,84

6,72

6,62

6,47

6,31

6,16

6,07

5,99

5,91

5,82

5,74

5,65

8

11,26

8,65

7,59

7,01

6,63

6,37

6,18

6,03

5,91

5,81

5,67

5,52

5,36

5,28

5,20

5,12

5,03

4,95

4,86

9

10,56

8,02

6,99

6,42

6,06

5,80

5,61

5,47

5,35

5,26

5,11

4,96

4,81

4,73

4,65

4,57

4,48

4,40

4,31

10

10,04

7,56

6,55

5,99

5,64

5,39

5,20

5,06

4,94

4,85

4,71

4,56

4,41

4,33

4,25

4,17

4,08

4,00

3,91

11

9,65

7,21

6,22

5,67

5,32

5,07

4,89

4,74

4,63

4,54

4,40

4,25

4,10

4,02

3,94

3,86

3,78

3,69

3,60

12

9,33

6,93

5,95

5,41

5,06

4,82

4,64

4,50

4,39

4,30

4,16

4,01

3,86

3,78

3,70

3,62

3,54

3,45

3,36

13

9,07

6,70

5,74

5,21

4,86

4,62

4,44

4,30

4,19

4,10

3,96

3,82

3,66

3,59

3,51

3,43

3,34

3,25

3,17

14

8,86

6,51

5,56

5,04

4,69

4,46

4,28

4,14

4,03

3,94

3,80

3,66

3,51

3,43

3,35

3,27

3,18

3,09

3,00

15

8,68

6,36

5,42

4,89

4,56

4,32

4,14

4,00

3,89

3,80

3,67

3,52

3,37

3,29

3,21

3,13

3,05

2,96

2,87

16

8,53

6,23

5,29

4,77

4,44

4,20

4,03

3,89

3,78

3,69

3,55

3,41

3,26

3,18

3,10

3,02

2,93

2,84

2,75

17

8,40

6,11

5,18

4,67

4,34

4,10

3,93

3,79

3,68

3,59

3,40

3,31

3,16

3,08

3,00

2,92

2,83

2,75

2,65

18

8,29

6,01

5,09

4,58

4,25

4,01

3,84

3,71

3,60

3,51

3,37

3,23

3,08

3,00

2,92

2,84

2,75

2,66

2,57

19

8,18

5,93

5,01

4,50

4,17

3,94

3,77

3,63

3,52

3,43

3,30

3,15

3,00

2,92

2,84

2,76

2,67

2,58

2,49

20

8,10

5,85

4,94

4,43

4,10

3,87

3,70

3,56

3,46

3,37

3,23

3,09

2,94

2,86

2,78

2,69

2,61

2,52

2,42

21

8,02

5,78

4,87

4,37

4,04

3,81

3,64

3,51

3,40

3,31

3,17

3,03

2,88

2,80

2,72

2,64

2,55

2,46

2,36

22

7,95

5,72

4,82

4,31

3,99

3,76

3,59

3,45

3,35

3,26

3,12

2,98

2,83

2,75

2,67

2,58

2,50

2,40

2,31

23

7,88

5,66

4,76

4,26

3,94

3,71

3,54

3,41

3,30

3,21

3,07

2,93

2,78

2,70

2,62

2,54

2,45

2,35

2,26

24

7,82

5,61

4,72

4,22

3,90

3,67

3,50

3,36

3,26

3,17

3,03

2,89

2,74

2,66

2,58

2,49

2,40

2,31

2,21

25

7,77

5,57

4,68

4,18

3,85

3,63

3,46

3,32

3,22

3,13

2,99

2,85

2,70

2,62

2,54

2,45

2,36

2,27

2,17

26

7,72

5,53

4,64

4,14

3,82

3,59

3,42

3,29

3,18

3,09

2,96

2,81

2,66

2,58

2,50

2,42

2,33

2,23

2,13

27

7,68

5,49

4,60

4,11

3,78

3,56

3,39

3,26

3,15

3,06

2,93

2,78

2,63

2,55

2,47

2,38

2,29

2,20

2,10

28 Apéndices

4

3

597

598

Tablas de distribución de la F (a) probabilidad 99% (p = 0,01) (cont.) gl Numerador

gl Numerador 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

12

15

20

24

30

40

60

120

∞

28

7,64

5,15

4,57

4,07

3,75

3,53

3,36

3,23

3,12

3,03

2,90

2,75

2,60

2,52

2,44

2,35

2,26

2,17

2,06

29

7,60

5,42

4,54

4,04

3,73

3,50

3,33

3,20

3,09

3,00

2,87

2,73

2,57

2,49

2,41

2,33

2,23

2,14

2,03

30

7,56

5,39

4,51

4,02

3,70

3,47

3,30

3,17

3,07

2,98

2,84

2,70

2,55

2,47

2,39

2,30

2,21

2,11

2,01

40

7,31

5,18

4,31

3,83

3,51

3,29

3,12

2,99

2,80

2,80

2,66

2,52

2,37

2,29

2,20

2,11

2,02

1,92

1,80

60

7,08

4,98

4,13

3,65

3,34

3,12

2,95

2,82

2,72

2,63

2,50

2,35

2,20

2,12

2,03

1,94

120

6,85

4,79

3,95

3,48

3,17

2,96

2,79

2,66

2,56

2,47

2,34

2,19

2,03

1,95

1,86

1,76

1,66

1,53

1,38

∞

6,63

4,61

3,78

3,32

3,02

2,80

2,64

2,51

2,41

2,32

2,18

2,04

1,88

1,79

1,70

1,59

1,47

1,32

1,00

Tablas de distribución de la F (cont.) probabilidad 95% (p = 0,05) 1

161,4

199,5

215,7

224,6

230,2

234,0 236,8

238,9

240,5

241,9

243,9

245,9

248,0

249,1

250,1

251,1

252,2

253,3

254,3

2

18,51

19,00

19,16

19,25

19,30

19,33 19,35

19,37

19,38

19,40

19,41

19,43

19,45

19,45

19,46

19,47

19,48

19,49

19,50

3

10,13

9,55

9,28

9,12

9,01

8,94

8,89

8,85

8,81

8,79

8,74

8,70

8,66

8,64

8,62

8,59

8,57

8,55

8,53

4

7,71

6,94

6,59

6,39

6,26

6,16

6,09

6,04

6,00

5,96

5,91

5,86

5,80

5,77

5,75

5,72

5,69

5,66

5,63

5

6,61

5,79

5,41

5,19

5,05

4,95

4,88

4,82

4,77

4,74

4,68

4,62

4,56

4,53

4,50

4,46

4,43

4,40

4,36

6

5,99

5,14

4,76

4,53

4,39

4,28

4,21

4,15

4,10

4,06

4,00

3,94

3,87

3,84

3,81

3,77

3,74

3,70

3,67

7

5,59

4,74

4,35

4,12

3,97

3,87

3,79

3,73

3,68

3,64

3,57

3,51

3,44

3,41

3,38

3,34

3,30

3,27

3,23

8

5,32

4,46

4,07

3,84

3,69

3,58

3,60

3,44

3,39

3,35

3,28

3,22

3,15

3,12

3,08

3,04

3,01

2,97

2,93

9

5,12

4,26

3,86

3,63

3,48

3,37

3,29

3,23

3,18

3,14

3,07

3,01

2,94

2,90

2,86

2,83

2,79

2,75

2,71

10

4,96

4,10

3,71

3,48

3,33

3,22

3,14

3,07

3,02

2,98

2,91

2,85

2,77

2,74

2,70

2,66

2,62

2,58

2,64

11

4,84

3,98

3,59

3,36

3,20

3,09

3,01

2,95

2,90

2,85

2,79

2,72

2,65

2,61

2,57

2,53

2,49

2,45

2,40

12

4,75

3,89

3,49

3,26

3,11

3,00

2,91

2,85

2,80

2,75

2,69

2,62

2,54

2,51

2,47

2,43

2,38

2,34

2,30

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Tabla 28.2.

13

4,67

3,81

3,41

3,18

3,03

2,92

2,83

2,77

2,71

2,67

2,60

2,53

2,46

2,42

2,38

2,34

2,30

2,25

2,21

14

4,60

3,74

3,34

3,11

2,96

2,85

2,76

2,70

2,65

2,60

2,53

2,46

2,39

2,35

2,31

2,27

2,22

2,18

2,13

15

4,54

3,68

3,29

3,06

2,90

2,79

2,71

2,64

2,59

2,54

2,48

2,40

2,33

2,29

2,25

2,20

2,16

2,11

2,07

16

4,49

3,63

3,24

3,01

2,85

2,74

2,66

2,59

2,54

2,49

2,42

2,35

2,28

2,24

2,19

2,15

2,11

2,06

2,01

17

4,45

3,59

3,20

2,96

2,81

2,70

2,61

2,55

2,49

2,45

2,38

2,31

2,23

2,19

2,15

2,10

2,00

2,01

1,96

18

4,41

3,55

3,16

2,93

2,77

2,66

2,58

2,51

2,46

2,41

2,34

2,27

2,19

2,15

2,11

2,06

2,02

1,97

1,92

19

4,38

3,52

3,13

2,90

2,74

2,63

2,54

2,48

2,42

2,38

2,31

2,23

2,16

2,11

2,07

2,03

1,98

1,93

1,88

20

4,35

3,49

3,10

2,87

2,71

2,60

2,51

2,45

2,39

2,35

2,28

2,20

2,12

2,08

2,04

1,99

1,95

1,90

1,84

21

4,32

3,47

3,07

2,84

2,68

2,57

2,49

2,42

2,37

2,32

2,25

2,18

2,10

2,05

2,01

1,96

1,92

1,87

1,81

22

4,30

3,44

3,05

2,82

2,66

2,55

2,46

2,40

2,34

2,30

2,23

2,15

2,07

2,03

1,98

1,94

1,89

1,84

1,78

23

4,28

3,42

3,03

2,80

2,64

2,53

2,44

2,37

2,32

2,27

2,20

2,13

2,05

2,01

1,96

1,91

1,86

1,81

1,76

24

4,26

3,40

3,01

2,78

2,62

2,51

2,42

2,36

2,30

2,25

2,18

2,11

2,03

1,98

1,94

1,89

1,84

1,79

1,73

25

4,24

3,39

2,99

2,76

2,60

2,49

2,40

2,34

2,28

2,24

2,16

2,09

2,01

1,96

1,92

1,87

1,82

1,77

1,71

26

4,23

3,37

2,98

2,74

2,59

2,47

2,39

2,32

2,27

2,22

2,15

2,07

1,99

1,95

1,90

1,85

1,80

1,75

1,69

27

4,21

3,35

2,96

2,73

2,57

2,40

2,37

2,31

2,25

2,20

2,13

2,06

1,97

1,93

1,88

1,84

1,79

1,73

1,67

28

4,20

3,34

2,95

2,71

2,56

2,45

2,36

2,29

2,24

2,19

2,12

2,04

1,96

1,91

1,87

1,82

1,77

1,71

1,65

29

4,18

3,33

2,93

2,70

2,55

2,43

2,35

2,28

2,22

2,18

2,10

2,03

1,94

1,90

1,85

1,81

1,75

1,70

1,64

30

4,17

3,32

2,92

2,69

2,53

2,42

2,33

2,27

2,21

2,16

2,09

2,01

1,93

1,89

1,84

1,79

1,74

1,68

1,62

40

4,08

3,23

2,84

2,61

2,45

2,34

2,25

2,18

2,12

2,08

2,00

1,92

1,84

1,79

1,74

1,69

1,64

1,58

1,51

60

4,00

3,15

2,76

2,53

2,37

2,25

2,17

2,10

2,04

1,99

1,92

1,84

1,75

1,70

1,65

1,59

1,53

1,47

1,39

120

3,92

3,07

2,68

2,45

2,29

2,17

2,09

2,02

1,96

1,91

1,83

1,75

1,66

1,61

1,55

1,50

1,43

1,35

1,25

'

3,84

3,00

2,60

2,37

2,21

2,10

2,01

1,94

1,88

1,83

1,75

1,67

1,57

1,52

1,45

1,39

1,32

1,22

1,00

28 Apéndices 599

600

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

Entre los controles de calidad de la fiabilidad de la pipeta se incluyen los siguientes: 1. Asegurarse de que todos los materiales que van a usarse están a temperatura ambiente. 2. Registrar el peso de un vaso de precipitado empleando una balanza de precisión sensible a 0,1 mg. 3. Registrar la temperatura de un tubo de agua destilada, rellenar la pipeta con el agua, limpiar el exterior de la punta y dispensar el agua en el vaso ya pesado con la punta tocando el lateral del vaso. 4. Registrar el peso del vaso más el agua y calcular el peso del agua. 5. Calcular el volumen (en μl) a partir del peso (en mg) y dividirlo por el factor de la temperatura ambiente (tabla 28.3). 6. Repetir el procedimiento diez veces, cambiando la punta cada vez. 7. Calcular la media, la DE y el CV del volumen dispensado. A partir de la media, calcular el porcentaje de desviación del volumen esperado mediante la fórmula: Volumen esperado – Volumen suministrado × 100 Volumen esperado Para procedimientos rutinarios, no debería diferir más de un 1,5%. El CV debería ser inferior al 1%.

ta calibrada de 0,2 ml y un frasco graduado de 50 ml. Se dispone de un equipo certificado comercial que se ajusta a estas medidas de acuerdo con los estándares nacionales; por otra parte la exactitud se puede evaluar por el procedimiento descrito previamente. Mezclar bien una muestra de 2-3 ml de sangre completa fresca y lisada (v. págs. 240-241). Seguidamente, diluir manualmente 1:251 en reactivo de cianometahemoglobina (v. pág. 25) empleando una pipeta calibrada y el frasco graduado. Al mismo tiempo, diluir una muestra de sangre en solución de cianometahemoglobina, por duplicado, mediante el autodiluyente. Leer la absorbancia de cada solución a 540 nm en un espectrofotómetro. La dilución mediante el autodispensador se obtiene de la fórmula: A1 ×

dilución (es decir, 1:251) A2

donde A1 = absorbancia a 540 nm de la dilución manual y A2 = absorbancia a 540 nm de la muestra autodiluida. Si está indicado, se debería hacer un ajuste apropiado al autodiluyente de acuerdo con las instrucciones del fabricante o aplicar un factor de corrección cuando se emplee el autodiluyente.

MICROSCOPIO

Componentes del microscopio AUTODILUYENTES Los sistemas autodiluyentes proporcionan una dilución constante de la sangre con el reactivo mediante un proceso simple. Para evaluar su exactitud, se requiere una pipe-

Tabla 28.3. Factor de la temperatura ambiente para la corrección de la razón peso:volumen Temperatura (°C)

Factor de volumen

18

0,9986

19

0,9984

20

0,9982

21

0,9980

22

0,9978

23

0,9976

24

0,9973

25

0,9971

26

0,9968

27

0,9965

28

0,9963

29

0,9960

30

0,9957

Los principales componentes de la mayoría de los microscopios rutinarios se ilustran en la figura 28.2. Los objetivos están habitualmente marcados con su poder de magnificación, pero las lentes más antiguas pueden estar marcadas por su longitud focal. Las equivalencias aproximadas son las siguientes: Longitud focal (mm) 2 4 16 40

Magnificación ×100 ×40 ×10 ×4

La distancia de trabajo del objetivo es la distancia entre el objetivo y el objeto que se visualiza. Cuanto mayor es el poder de magnificación del objetivo, más pequeña es la distancia de trabajo: Objetivo ×10 ×40 ×100

Distancia de trabajo 5-6 mm 0,5-1,5 mm 0,15-0,20 mm

Estas especificaciones indican que cuando se usa un cubreobjetos, si es demasiado grueso, puede que no sea posible enfocar con elevada magnificación. Por ello, el cubreobjetos no debería tener un grosor mayor de 0,15 mm para el examen de preparaciones cubiertas mediante el objetivo de inmersión en aceite ×100. Además, si el cristal del portaobjetos es demasiado grueso, podría impedir el enfoque correc-

28 Apéndices

E

B

7. Abrir completamente el diafragma para que la luz cubra el campo de visión completo. 8. Retirar los oculares, de manera que la lente superior del objetivo esté completamente ocupada por un círculo de luz. Cerrar el diafragma lentamente hasta que el círculo de luz ocupe dos tercios de la superficie. 9. Recolocar los oculares, volver a enfocar la muestra y si es necesario volver a ajustar la apertura del condensador y el brillo de la lámpara para obtener la imagen más nítida posible.

Examen de portaobjetos O P

C

Figura 28.2. Corte transversal de un microscopio, mostrando sus componentes. B, brazo; C, condensador; E, oculares; O, objetivo; P, platina mecánica. La línea discontinua indica la trayectoria de la luz. Obsérvese que se muestra una fuente de luz externa que se dirige al interior del microscopio. En la mayoría de los microscopios modernos hay una lámparaa incluida en la base.

to de la trayectoria de la luz a través del condensador hasta el objeto, como se describe más adelante.

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Ajuste de la iluminación del microscopio 1. Si el microscopio requiere una fuente de iluminación externa, usar el espejo de la base dirigiendo la luz hacia el condensador. Si la fuente lumínica está incluida en el microscopio, asegurarse de que el voltaje de la lámpara esté bajo antes de encender el microscopio; entonces, subir la lámpara hasta el 70% de la potencia máxima. 2. Colocar un portaobjetos de un frotis sanguíneo con un cubreobjetos sobre la platina. 3. Bajar el condensador, abrir el diafragma completamente, y enfocar la preparación del portaobjetos con el objetivo ×10. 4. Comprobar que los oculares están ajustados a la distancia interpupilar del observador y que la muestra está enfocada para cada ojo, mediante rotación del mecanismo de enfoque de los oculares ajustables. 5. Cerrar el diafragma y elevar el condensador lentamente hasta que el borde del círculo de luz esté nítidamente enfocado. 6. Usando la rueda para centrar el condensador, ajustar su posición para que el círculo de luz esté en el centro del campo.

Bajo aumento (×10). Empezar con el objetivo justo sobre la preparación del portaobjetos. Seguidamente, elevar el objetivo con los tornillos de enfoque macrométrico hasta que se vea una imagen clara por los oculares. Si la iluminación es insuficiente, subir el condensador ligeramente. Gran aumento (×40). Subir el condensador hasta la mitad; bajar el objetivo hasta que esté justo sobre la preparación del portaobjetos. Usar el enfoque macrométrico para elevar el objetivo muy lentamente hasta que se obtenga una imagen borrosa. Seguidamente, enfocar usando el enfoque micrométrico. Si es necesario, elevar el condensador para obtener la iluminación suficiente. Aceite de inmersión (×100). Colocar una pequeña gota de aceite de inmersión en la parte que debe examinarse. Subir el condensador tanto como se pueda. Bajar el objetivo hasta que esté en contacto con el aceite. Colocarlo tan cerca como sea posible del portaobjetos, pero evitando presionar la preparación. Mirar a través de los oculares y girar el enfoque micrométrico hasta que la imagen esté enfocada. Después de usar el objetivo con aceite de inmersión, para evitar rayar la lente o cubrir la lente de ×40 con aceite, primero girar el objetivo ×10 (o un espacio sin lente en el revolver) para colocarlo en la zona central antes de quitar el portaobjetos. Siempre que sea posible, emplear aceite sólo cuando sea esencial (p. ej., determinación de las especies de malaria), y examinar los frotis de sangre para recuento diferencial de leucocitos con la lente de ×40 sin aceite.

MANTENIMIENTO RUTINARIO DEL MICROSCOPIO El microscopio es un instrumento delicado que debe ser manejado con cuidado. Debe instalarse en un entorno limpio lejos de productos químicos, luz solar directa, fuentes de calor o humedad. Si la platina está contaminada con solución salina, debe limpiarse inmediatamente para evitar corrosión. Incluso en un clima templado, la humedad y las elevadas temperaturas causan crecimiento de hongos, que pueden dañar las superficies ópticas. Dado que el almacenaje en un compartimento cerrado promueve el crecimiento de hongos, no debe almacenarse en su caja de madera sino dejarse de pie sobre la encimera protegido por una funda de plástico ligera. Después de usar las lentes, limpiar el objetivo de inmersión con un paño para lentes, un papel absorbente, un paño sua-

601

602

HEMATOLOGÍA PRÁCTICA

ve o algodón médico. Si las otras lentes se han manchado con aceite, limpiarlas con un poco de tolueno o una solución de éter de petróleo al 40%, etanol al 40% y éter al 20%. Las lentes nunca deben sumergirse en alcohol, porque éste puede disolver el pegamento. Limpiar las partes no ópticas con detergente suave y quitar la grasa o aceite con éter de petróleo, seguido de etanol al 45% en agua. Quitar el polvo del interior y exterior de los oculares con soplador o cepillo suave de pelo de camello. Limpiar el condensador del mismo modo que las lentes con un paño o tejido suave humedecido con tolueno y limpiar el espejo (si existe) con un paño suave humedecido con alcohol al 5%. El diafragma es muy delicado, y si se daña o se oxida mucho, generalmente necesita ser reparado. No forzar nunca los mandos. Si notamos dificultad al mover los tornillos de enfoque o la platina mecánica, lubricarlos con una gota de aceite para máquinas. Todas las partes móviles accesibles deberían limpiarse de vez en cuando y ser engrasadas para protegerlas de la corrosión. No emplear aceites vegetales porque se secan y endurecen. Mantener siempre la superficie fija de la platina seca porque el movimiento de portaobjetos húmedos requiere más fuerza, lo que podría dañar la platina mecánica.

Climas cálidos y húmedos En los climas cálidos y húmedos, si no se toman precauciones, pueden desarrollarse hongos en los microscopios (especialmente en la superficie de las lentes y en las ranuras de los tornillos) con lo que los instrumentos quedarán pronto inutilizables. Esto puede prevenirse como sigue. Todas las tardes, colocar el microscopio en una funda hermética al polvo junto con gel de sílice. Cuando sea necesario, secar el gel de sílice y reutilizarlo. Un método alternativo es colocar el microscopio en un armario templado. Éste es un armario con una puerta con cierre ajustado, calentado por una bombilla de luz de 40 watios. Comprobar que la temperatura en el interior del armario sea al menos 5 °C más cálida que la del laboratorio, pero tener cuidado de que no esté excesivamente caliente.

Climas cálidos y secos En climas cálidos y secos, el principal problema es el polvo. Las finas partículas penetran entre las roscas de los tornillos y bajo las lentes. Esto puede evitarse como sigue: 1. Mantener el microscopio, siempre que no se use, bajo una funda de plástico impermeable al polvo. 2. Al final de la jornada, limpiar el microscopio minuciosamente echándole aire con una perilla de goma. 3. Terminar de limpiar las lentes con un cepillo para lentes o un pincel fino. Si persisten partículas de polvo sobre la superficie de los objetivos, eliminarlas con un papel limpio.

SANGRE DESFIBRINADA Para obtener glóbulos rojos no coagulados sin añadir anticoagulantes (p. ej., para la investigación de ciertos tipos de

Figura 28.3. Recipiente para desfibrinación de 10-50 ml de sangre. La vara de cristal tiene unos pequeños fragmentos de capilares de cristal alargados fusionados en su extremo inferior.

anemia hemolítica) la muestra puede ser desfibrinada. Esto puede realizarse colocando la sangre en un recipiente tal como un frasco cónico que contenga una vara de cristal central sobre la que se han fusionado pequeños trozos de capilares de cristal (fig. 28.3). La sangre es batida alrededor de la vara central por una rotación moderadamente rápida del frasco. La coagulación es normalmente completa en 5 min, quedando la mayoría de la fibrina en la vara central. Cuando la formación de fibrina parece completa, debe retirarse la vara de cristal del frasco. La morfología de los glóbulos rojos (y también de los leucocitos) queda bien preservada. Si también se requiere suero, la sangre desfibrinada puede centrifugarse y el suero puede obtenerse rápidamente y en volúmenes relativamente grandes. BIBLIOGRAFÍA 1. Moore HC, Mollison PL 1976 Use of a low-ionic-strength medium in manual tests for antibody detection. Transfusion 16:291. 2. Hendry EB 1961 Osmolarity of human serum and of chemical solutions of biological importance. Clinical Chemistry 7:156. 3. World Health Organization 1977 The SI for the health professions. WHO, Geneva.

Índice alfabético

Nota: Los números en cursiva hacen referencia a figuras y tablas.

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A ABC de la informática médica, 542 ABI 3700 ADN Analyser, 495 Absorbancia (δA), 24, 25, 26, 122 Absorción del hierro de la dieta, 114 Acantocitos, 71, 82, 85, 87, 88 Acantocitosis, 81, 88 ACD. Véase Ácido citrato dextrosa Acetato de celulosa, 241-4 de cinc, 169, 253 de sodio, 119 Acetilfenilhidrazina, 169 Ácido acético, 163 glacial, 41 aminolevulínico, 169, 170 ascórbico, 147 citrato dextrosa (ACD), 2, 5 cítrico monohidrato, 119 desoxirribonucleico (ADN) análisis, 263, 272, 333, 357, 477-8, 483, 524, 582 de la secuencia, 485 analizador, 496 complementario (ADNc), 478, 507 concentración, 499 de las células nucleadas, 45 extracción, 478 fetal, 465 fragmentos, 496 genómico, 479, 497-9 genotipificación de los eritrocitos, 456 marcadores, 496 molécula, 477 polimerasa, 478 recombinante, 507, 517 reticulocitos, 35 secuencia, 479-494 síntesis, 140-147 Taq polimerasa, 479, 491, 492, 504 técnicas de amplificación, 465 tecnología, 239 tinción con plata, 502 etilendiaminotetraacético (EDTA), 2, 5-6, 7, 24, 51, 97, 120, 171, 182, 271, 288, 426, 512, 513, 564, 580

anticoagulante, 103 sal dipotásica, 5 tripotásica, 5 flufenámico, 221 folínico, 148 mefenámico, 221 metilmalónico, (AMM), 139-40, 152 urinario, 146 p-aminosalicílico, 221 perclórico (APC), 191 peryódico de Schiff (PAS), 268 reacción, 277-279 tinción, 279 pteroilglutámico (APG), 146, 150 ribonucleico (ARN) análisis, 300 proteínas ligadas, 115 recuento de plaquetas, 45 reticulocitos, 32, 35 sulfúrico, 120 tartárico, 277 tricloroacético (TCA), 199 Acidosis, 200 Aclorhidria, 156 Acreditación, 547-9 Activación de las enzimas fosfolipasa (PLA2), 328 del factor tisular (FT), 328 Activador del plasminógeno, (AP), 14, 331, 390, 392 tipo urocinasa (uPA) tisular recombinante (APT-r), 409 tisular del plasminógeno (tPA), 329, 331, 392 Actividad de la fosfatasa alcalina de los neutrófilos (FAG), 276 de unión de colágeno (FVW:CB), 359, 362 del cofactor de la ristocetina (VWF:RCo), 359 eritropoyética, 32, 171 Acumulación, 540 Acúmulos dispersos, 92 Adamantil dioxetano fosfato, 149 ADE. Véase Amplitud de la distribución eritrocítica

Adenosina 5’-difosfato (ADP), 358 monofosfato cíclico (AMPc), 328 Adhesión de las plaquetas, 97 Administration of Radioactive Substances Advisory Committee (ARSAC), 306 ADN. Véase Ácido desoxirribonucleico ADPasa (adenosina difosfatasa), 326 Advanced Applied Biosystems (ABI), 470 AET. Véase Bromuro de 2-aminoetil-isotiouronio Agar citrato, 246 Aglutinación en columnas, 454, 450, 457, 466 Aglutininas, 40 frías, 5, 14 Agrupación según el ABO, 214, 452, 463 Agrupamiento D, 453-57, 464 Agujas, 1-4 autorretenedoras, 310 de microtrepanación, 108 de Salah, 101, 102 desechables, 2 Islam para aspiración de medula ósea, 102 Klima, 101, 102 Osgood, 108 palomilla, 2, 310 Vim-Silverman, 108 Alarmas en los recuentos sanguíneos automatizados, 47 Albúmina de suero bovino (ASB), 119, 439 sérica humana (ASH), 310 Alcohol absoluto, 55 etílico, 55 metílico, 55 Aldolasa, 187 Aloanticuerpos, 434, 437 Alteraciones cuantitativas de los eritrocitos, 521-2 Altos del Golán, 133 American Association of Blood Banks (AABB), 425, 450 Diagnostica, 388

604

ÍNDICE ALFABÉTICO

Aminoácido disulfuro, 152 AMM. Véase Ácido metilmalónico Amplitud de la distribución eritrocítica (ADE), 255 Anafilaxis, 471 Análisis anticardiolipina, 384 citogenético, 100 hibridación por fluorescencia in situ (FISH), 488, 489 leucemia, 485-96 linfoma 485-96 cromogénico, 390 DAFO, 536 de células falciformes, 251, 482 de Clauss, 344-5, 356 de cobalamina causas, 148 en suero, 145 estándares, 145, exactitud, 145, 147 investigación, 141, 144-5, 145-8 métodos, 148 precisión, 145 de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA), 117, 259, 332, 385, 408, 517, 582 ligado a la enzima Clq, 438 de la altura del impulso, 39 de la forma de la onda, 339, 340 de las enzimas eritrocitarias, 192-5 de los datos, 566 EQA, 569 de los ensayos, 339-42 de repeticiones cortas en tándem (STR), 480, 497 del cofactor de la ristocetina, 360, 362, 372 del fibrinógeno, 5, 14, 19, 59, 163, 344 del folato, 7, 528 causas, 148 en suero, 145 eritrocitos, 141, 143 estándares, 145 exactitud, 145, 146 métodos, 148-9 precisión, 145, 146 del polimorfismo de conformación de cadena única (SSCP), 480, 496 Maipa, 442-3 molecular análisis del ADN, 477-8 extracción del ADN, 478 reacción en cadena de la polimerasa (PCR), 478-81 por encima del tiempo, 340, 340 Analizadores automatizados, 15 de la coagulación, 334 de acceso aleatorio, 149 de recuentos sanguíneos automatizados, 567 IL ACL, 339 portátil, 129 Proto Fluor Z, 129 Anemia, 523

aplásica, 72, 86, 100, 101, 139, 140, 223, 527 autoinmune «idiopática» por anticuerpos calientes, 179 clínica, 24 congénita eritropoyética, 139, 140 de Blackfan-Diamond, 239 de células en espuela, 81 falciformes, 29, 83-4, 89, 164, 318 de Fanconi, 239 del deportista, 18 diseritropoyética congénita, 72-73 de tipo II (ADCII), 182 ferropénica, 72-3, 73-5, 76, 89, 113-33, 181, 521 capacidad de fijación del hierro, 124 determinación de la capacidad no saturada de fijación de hierro, 124-5 estado del hierro, 116 ferritina sérica, 117 hierro sérico, 121-4 inmunoanálisis de la ferritina, 117-22 metabolismo del hierro, 113-6 protoporfirina eritrocitaria (PE), 129 saturación de la transferrina, 124, 126 transferrina sérica, 124-9 fetal, 466 hemolítica, 33, 70, 77-78, 177, 186, 210, 221, 521, 527, 602 aloinmunitaria, 206 autoinmune, 72, 182-183, 318, (AHA), 206 inducida por fármacos, 220, 222 catabolismo de la hemoglobina, 168-9 con cuerpos de Heinz, 236 con hemoglobina, 77, 78 congénita, 72 examen del plasma, 167-8 haptoglobina sérica 164-7, 165-6 hemoglobina plasmática, 163-4 hemopexina sérica, 167 hemosiderina en la orina, 168 hereditaria análisis de la piruvatocinasa, 195-6 de las enzimas eritrocitarias, 192-5 de las proteínas de la membrana, 186 autohemólisis, 184-6 criohemólisis, 184 defectos de la membrana, 178 del metabolismo eritrocítico, 190, detección de los déficits enzimáticos, 186-8 2, 3-difosfoglicerato, 198-200 fragilidad osmótica, 178-82 glutatión, 196-8 no esferocítica, 179 prueba de fijación al colorante, 182-3 de la citometría de flujo, 182-3

de la pirimidina-5’-nucleotidasa (P5N), 191-2 de reducción de la metahemoglobina, 189-90 del tiempo de lisis con glicerol, 183-4 inducida por oxidantes, 78, 222-23 inmune, 90 investigación, 162-3 microangiopática, 72, 70, 70, pigmentos de hemoglobina anómalos, 171-174 porfirinas, 169-171 poscirugía cardíaca, 70 hemolítica adquirida evaluación de la extensión sanguínea, 205 hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), 223-8 inducida por oxidantes, 222-23 inmunitaria, 205-22 mecánica, 223 microangiopática, 223 probabilidad, 205 hipocrómica, 29 leucoeritroblástica, 86 macrocítica, 29, 139, 524, 527 megaloblástica, 72, 74, 74, 92, 102, 139-57, 223, 521 análisis de fijación competitiva a proteínas, 149 de la B12 sérica, 149-50 de la holotranscobalamina, 156-7 características hematológicas, 140-1 déficit de folato, 140, 141-4, 146 determinación de la homocisteína, 152-4 investigación de la absorción de B12, 155 de la sospecha de cobalamina, 139, 141-4, 147-8 medición de la transcobalamina, 156 métodos de análisis de la cobalamina, 148-9 del folato, 148-9 eritrocítico, 150-2 sérico, 150 pruebas para los metabolitos, 152 microcítica, 523, 523, 24, 527 normocítica, 524, 25, 525, normocrómica, 525 perniciosa, 72, 145, 154, 169 por enfermedad crónica (AEC), 116 sideroblástica, 269 adquirida, 75, 75, 76 Anisocitosis, 58, 71, 71-4, 75, 77 Anisocromía, 69, 72, 74, 75 Ankirina, 182 Anomalía de Alder-Reilly, 91 de May-Hegglin, 91, 96 Anorexia nerviosa, 106 ANOVA, 595 Antec-DuPont, 478 Anti-ciclina D1, 298

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ÍNDICE ALFABÉTICO

Anticoagulantes, 5-6, 590-91 Anticuerpo anticardiolipina (AACL), 370 de Paul-Bunnell, 516 marcador, 359 monoclonal (AcMo), 227 Anticuerpos ABO, 413 anti-A, 428 anti-B, 428 anti-C, 208 anti-Ce, 464 anticomplemento, 208 anti-E, 464 anti-factor intrínseco (AcFI), 154 anti-Fya, 464 anti-Jka, 464 anti-Lea, 428 anti-P, 428 antipenicilina, 221 anti-PP1Pk, 428 anti-Tja, 428 de Donath-Landsteiner (D-L), 209 de GTI Pak Plus, 443 dependientes de fármacos, 437 Duffy, 420, 423 HLA, 437 IgG, 464 incompletos, 211 independientes de fármacos, 221 inducidos por fármacos, 437, 438 inmunoglobulina M (IgM), 526 Jk, 421 Kell, 420 Kidd, 420, 420 Leb, 428 Lewis, 418 Lutheran, 421 monoclonales, 100 (AcMo), 287 penicilina, 221 policlonales, 100 Rh, 423 Antígenos ABO, 414-7 crípticos, 438 de neutrófilos humanos (HNA), 434 Duffy, 420 receptores para las quimiocinas (ADRQ), 420 Kidd, 420 Lewis, 418 MNS, 420 ocultos, 438 plaquetarios humanos (HPA), 434 Antiglobulina humana (AGH), 211, 458 Anti-Lua, 421-2 Anti-Lub, 421-2 α2-antiplasmina (AP), 331, 393, 394 α1-antitripsina, 514 Antitrombina (AT), 5, 14, 378-70, 384, 403 Aparición de oquedades (pitting), 58 Apófisis espinosas, punción, 101 Apoptosis, 7, 108 Aprotinina, 410

Archives of Pathology and Laboratory Medicine, 550 Área de absorbancia milimolar, 25 ARN mensajero (ARNm), 115, 237, 480 ASB. Véase Albúmina de suero bovino Asignación del genotipo, 376 Aspectos macroscópicos de la aglutinación, 429 Aspiración, 100 Aspirados esplénicos, parásitos, 60 Atrofia esplénica, 84-5 Auditoría del laboratorio, 547-9 Autoaglutinación, 85 y cilindros, 85 Autoanticuerpos, 428, 436-39 antiplaquetarios, 97 calientes, 207, 214 fríos, 208 granulocíticos, 437 IgA, 220 Autoclave, 1 Autodiluyentes, 600 Autopruebas del paciente, 546 Axis-Shield, 153 Azatioprina, 141 Azida sódica, 24, 26, 362 Azida-hemoglobina, 24 Azidotimidina (AZT), 141 Azul de cresil brillante, 32, 271 de metileno, 32, 57, 65, 189 policromo, 53

B B12 radioactiva, 155 Babesiae, 60, 66 Babesiosis, 66 Bacterias, 91, 91, 92 Banda 3, 182 Basofilia, 522 Basófilos, 93, 94, 523 Bastones de Auer, 70, 273, 280, 281, 531 Bayer Centaur, 149, 153 immuno 1, 150 Bayer-Technicon Systems, 37 Beckman-Coulter Access, 150 LH750, 43 Bencidina, 163 Bilirrubina, 148, 169 Bioensayo en línea paralela de factor VII, 350 Biomerieux, 339 Biopsia de la cresta ilíaca, 100, 109, 111 por trepanación, 99, 106, 108 Bio-Rad, 153 Borato, 119 Borde celular, 77 British Committee for Standards in Haematology (BCSH), 295, 425, 450, 546, 562 Bromuro de 2-aminoetil-iso-tiouronio (AET), 228 de difeniltetrazolio, 187

Brugia malayi, 65 timori, 65 Busulfán, 523

C Cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH), 300 Calcio, 5 Calibración, 337 de los recuentos sanguíneos automatizados, 46 gráfico, 168, 174 valor, 46 Calicreína, 331 Cámara de recuento de Neubauer, 579 Cambios transitorios, 17 Cáncer hepático primario, 156 Capacidad de fijación del anticuerpo (CFA), 291 insaturada de fijación de hierro (UIBC), 125, 313 total de fijación de hierro (TIBC), 124 Caquexia, 106 Características morfológicas de la apoptosis, 8 operativas del receptor (ROC), 539 Carbonato de magnesio (MgCO3), 124 Carboxihemoglobina (HbCO), 19, 24, 171, 174, 272 Carcinoma de células metastásicas, 105, 523 Carcinomas, 100 CD4K 530, recuento de reticulocitos, 45 CD55, 224, 226 CD58, 226 CD59, 224 Cebadores, 492 específicos de la secuencia de la PCR (PCR-SPP), 444 Cefalosporinas, 221 CellVision AB, 43 Células asesinas naturales, 94 contraídas, 89 crenadas, 81 de Kupffer, 167 de la fiebre glandular, 95 de Türk, 94, 95 diana, 71, 825, 87 en casco, 81 en erizo, 79 en lágrima, 72 en lápiz, 72 en mordisco, 81 eritroides, maduración, 106 falciformes, 83, 84, 84 hematopoyéticas, 109 hipocrómicas, 73, 76, 87, 89 mononucleares, 59 atípicas, 95 no hematopoyéticas, 105 normocíticas, 75 plasmáticas, 95 sanguíneas concentración, 58-60

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Células (cont.) separación, 58-60 seudo-Pelger, 93 Central Laboratory of Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service (CLB), 592 Centre for Health Planning en la Universidad de Keele, 550 Centrifugación, 103, 336 con gradiente de densidad, 288 velocidad, 592 Centrífugas, 29, 122, 124, 169, 184, 199, 215, 225, 247, 309, 334, 383, 557 Cetrimida, 41 Chance 0 Gr 1, 27 CHCM. Véase Concentración de hemoglobina corpuscular media Chequeo delta, 47, 571 Cianocobalamina, 149, 155 Cianuro, 24, 173 de hemoglobina (HiCN), 163 a partir de la hemoglobina, 26 diluciones, 26 método, 24 patrón de referencia, 25-6 potásico (KCN), 149, 172, 249 y reactivo ferrocianuro, 27 y solución de ferrocianuro (Drabkin), 184 Ciclo menstrual, 130 Cilindros hemáticos, formación, 58, 95 Cinetoplasto, 62 Citocinas, 7 Citomegalovirus (CMV), 451 Citometría de flujo, 227, 372 activación plaquetaria, 394-5 contadores diferenciales automatizados, 42 inmunofenotipación, 574 métodos, 288 multicolor, 291-93 representación de puntos, 299 utilización, 442 Citoplasma, 7, 93-5 abundante, 94, 95 basófilo, 95 encogimiento, 106 Citoquímica eritrocítica derivados de la hemoglobina, 270-73 sideroblastos, 266-70 siderocitos, 266-70 leucocitaria clasificación de las leucemias, 284 esterasas, 279-80 mieloperoxidasa (MPO), 273-75 naftol AS-D cloroacetato esterasa, 280-3 reacción de la fosfatasa ácida, 276-7 del ácido peryódico de Schiff, 277-9 reacciones citoquímicas, 284 sudán negro B (SNB), 275 tinción con toluidina azul, 283-84 Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), 422 Citrato sódico, 6, 163 trisódico, 2, 6

Citrato-fosfato-dextrosa (CPD), 5, 151, 563 Clasificación de las anemias, 281 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 5, 335, 562 Benchmarking Company, 550 management unit, 550 Pathology Accreditation, 536 Clorhexidina, 2, 100 Clorhidrato de fenilhidrazina, 172 Cloroacetato esterasa, 280 Cloroformo, 170 4-cloro-1-naftol (4CN), 273 Clorpropamida, 221 Cloruro de hemina, 24 Clostridium perfringens lecitinasa, 76 septicemia por, 77 Coagulación estabilidad de las pruebas, 7 intravascular diseminada (CID), 332, 385, 405 sanguínea análisis, 332 inhibidores, 331-2 técnicas, 333 trastornos, 483-5, 521 Coagulopatías, 7 Cobas Argos 5, contador automatizado de sangre completa, 42 Cocientes celulares, 105 leucoeritroide, 105 linfoide, 105 Código de práctica segura de laboratorio, 584 Coeficiente de correlación, 541 de extinción (ε), 197 milimolar, 27 de variación (CV), 13-14, 36, 41, 127, 145, 538, 564 elegido (CVE), 541 College of American Pathologists, 537 Coloide etiquetado con 99mTc, 319 Colorante azul de toluidina, 283 o-dianisidina, 165 Colorantes de Romanowsky, 6, 53-5, 70, 102, 109 Colorímetro fotoeléctrico, 24 Colorímetros, 24 Comité Européen de Normalisation (CEN), 562 Commission for Health Improvement (CHI), 550 Comparativa, 550 Complejo B12 transcobalamina I, 140 II, 140 cuaternario Xa-TF-VIIa-TFPI, 329 de ataque a la membrana (MAC), 422 fosfatasa alcalina-ligando, 149 haptoglobinas y Hb, 167 hemoglobina-haptoglobina, 116 inactivo trombina-antitrombina (TAT), 331, 395

transferrina-receptor de la transferrina, 115 Componentes del complemento, 423 Comprobación de la correlación, 568 Compuesto de albúmina y hemo, 167 de bencidina, 163 de tetrazolio soluble (MTT), 190 Concentración de FVW:Ag, 359-60, 362 de hemoglobina (Hb), 4, 14-16, 19, 37, 74, 116, 184, 205, 521, 563, 574 corpuscular media (CHCM), 6, 14, 16, 30, 131, 238, 309-10, 523, 568-9 amplitud de la distribución (ADH), 40-1 cambios, 17 en cianuro de hemoglobina, 24 en el embarazo, 17 escala de color, 578 medición, 24 método de referencia del ICSH, 29 síntesis, 41 Concentraciones moleculares, 593 Condensación de cromatina, 95, 96 Constante de Hill (n), 201, 254 de Michaelis (Km), 195 Contador automatizado de sangre completa, serie H de Bayer, 42 LH 700, 42 total, Advia, 42 Contadores electrónicos, fiabilidad, 37-9 Contaje de superficie, 307 Contracción irregular, 71 Control de anticoagulantes orales, 575 de calidad, 242, 337, 425, 513, 546 análisis de los datos, 566-9 comprobación delta, 568 de las centrífugas para lavar células, 432 de los reactivos antiglobulina, 430 materiales para el control de la calidad, 563-6 preparaciones de referencia, 563 procedimientos, 571 protocolo para los laboratorios de diagnóstico, 571-572 valoración externa de la calidad, 569-71 financiero, 537 interno de la calidad, 561 Coproporfirina, 169-70 Corel Draw Graphics Suite, 363, 365 Corrección de la casualidad, 38 Coste de las pruebas, cálculo, 537-8 Coulter STKS, contador automatizado de sangre completa, 42 Wallace, 37 CPD. Véase Citrato fosfato dextrosa Crenación, 7, 77, 81-2, 88 Crioglobulinas, 40 Crioglobulinemia, 58 Criohidrocitosis, 182 Crisis blástica, 94 Cristaseal®, 28

ÍNDICE ALFABÉTICO

Cromatina, 94 Cromatografía, 256 capilar en fase gaseosa, 153 en fase líquida de alta resolución (HPLC), 139, 240, 246, 524 en microcolumnas, 244 Cromo radioactivo (51Cr), 309, 315 Cromosoma 9, loci genéticos, 415 Cuantificación, 293 de antígenos, 291, 292 Cuentas de látex, 39 Cuerpos apoptósicos, 8 de Döhle, 91 de Heinz, 34-5, 77, 81, 163, 222, 263, 270 de Howell-Jolly, 46, 61, 70, 71, 84-7, 85, 85, 87 de Leishman-Donovan, 62, 64 de Pappenheimer, 35, 70, 71, 73, 84-5, 89, 268 Curva de disociación del oxígeno, 200-1 de Gauss, 12, 12 de supervivencia de los eritrocitos con 51Cr, 317, 318 Cutánea tarda, 171 CV. Veáse Coeficiente de variación

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D Daño mecánico, 81 oxidativo, 72 Dapsona, 81 DDAVP (1-desamino-8-D-arginina vasopresina), 391 Decon90, 307 Déficit de cobalamina, 17 de deshidrogenasa (G6PD), 162 de folato, 140, 143-5, 146-8 de G6PD, (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), 78, 81, 177, 185, 187, 187, 190, 190, 193-5, 205, 222, 263, 270, 270, 496 detección de heterocigotos, 189 prueba de detección por fluorescencia, 187 de la 2, 3-difosfoglicerato mutasa, 200 de P5’N, 191-2 de piruvatocinasa (PK), 180, 181, 187, 195-6 de selenio, 78 del factor IX, 375, 460 VIII, 375, 395 Degranulación plaquetaria, 6 Deleción del pb 619, 482, 483 Densidad óptica (DO), 25, 359 Depósito de orina, microfotografía, 168 Depósitos de hierro, 116, 116 Derivado de dos cadenas (tcu-PA), 331 Desarrollo profesional continuo, 536 Desintegración diferencial, 308 2-desoxiG6P (2dG6P), 195 Desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), 287, 291

Desproteinización, 199 Desviación estándar (DE), 12, 14, 538, 566, 569 Detección de anticuerpos, 457-9, 464 de antígenos intracelulares, 290 de eluidos, 217 de la mononucleosis infecciosa, 517 neonatal, 252 Detectores electroópticos, 37 Determinación del fenotipo, 459 Dextrano, 59 Dextrosa, 5 Diagnostic Products Immulite 2000, 149-50, 153 Diagramas de dispersión, 43 Diaminobenzidina (DAB), 302 Diclorhidrato de o-fenilendiamina, 119 2,6-diclorofenolindofenol (DCIP), 582 Dietilaminoetil (DEAE) celulosa, 257 Diferencial en los recuentos sanguíneos automatizados, 42-4 DiffMaster, 43 Difosfoglicerato fosfatasa, 187 Difosfogliceromutasa, 187 Dilución, 27 de radioisótopos (RID), 150 Dimetilsulfóxido (DMSO), 54, 482 Dimorfismo, 71 Directiva del Consejo y el Parlamento Europeo, 562 Europea de la Sangre, 450 Directrices de las Canadian Health Service Organizations, 537 para las pruebas de compatibilidad de la BCSH, 431 Diseritropoyesis, 46, 72 Disfunción plaquetaria, 369 Disodio hidrógeno fosfato (Na2HPO4), 57, 251 Dispersión frontal (FSC/FSc), 40 lateral (SSC/SSc), 40 lumínica, 37 instrumentos, 39 Dispositivos de diagnóstico médico in vitro (IVDMD), 562, 569 Distribución asimétrica, 12 del hierro corporal, 116 gaussiana, 12, 538 logarítmica normal, 12, 12 Ditionito sódico (Na2S2O4), 251 Ditiotreitol (DTT), 149, 220, 247 DMSO. Véase Dimetilsulfóxido Documento de guía ILAC G13/2000, 549 de la Association of Clinical Pathology Best Practice, 169 Dodecyl sulfato sódico (SDS), 186 Dosis de radiación, 593 Drabkin reactivo, 25, 26, 225 solución, 184 Drew Scientific, 153 Drummond Scientific, 29

E E170, 149 Ecarina, 383 Echis carinatus, 383 EDTA. Véase Ácido etilendiaminotetraacético Efecto Bohr, 201 Romanowsky, 53 Ehrlichiosis, 60, 65 Electroforesis, 164-5, 167 alcalina de la cadena de globina, 247 capilar, 497 de la cadena de globina, 247 de la hemoglobina, 240 en gel de poliacrilamida, 501-2 realización, 249 Eliminación de residuos, 3, 558 Eliptocitos, 72, 76, 79 Eliptocitosis, 71, 78, 526 hereditaria (ElH), 79, 181-182, 186 ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas), 154 Elución, 316 caliente, 217, 439 por congelación y descongelación, 217 Elusión de éter, 439 Embarazo, 17, 133, 466 Emisor de rayos-γ, 315 EN. Véase Eritrocitos nucleados Encogimiento celular, 109 Enfermedad cardíaca congénita, 522 celíaca, 97 de Chagas, 64 de Crohn, 94 de Hodgkin, 108 de la hemoglobina H, 75, 83, 255 de las células falciformes, 235, 240, 251, 263, 481, 482 de Paget, 109 hematológica clasificación de las neoplasias, 529-33 presentaciones comunes, 521 pruebas específicas, 527-29 iniciales de detección, 521-27 hemolítica ABO, 76 del recién nacido (EHRN), 217, 168 mínima residual (EMR), 287, 289 por depósito, 527 por Hb H, 241, 271 por hemaglutinina fría crónica, 74 por hemaglutininas frías (CHAD), 208, 422 Enolasa, 187 Ensayos amidolíticos, 333, 392 de aptitud, 190 Enzimas de restricción (ER), 478, 502, 507 Enzimopatías, 526 Eosina Y, 53-457 Eosina-5-maleimida (EMA), 182 Eosinofilia, 522 Eosinófilos, 15-16, 30, 53, 60, 90, 94, 526 Equinocito, 79 Equinocitosis, 82-3 Equipo Quantase, 190

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Equipos de inmunoanálisis enzimáticos, 126 Eritroblastos, 87, 87 Eritroblastosis, 71, 86 Eritrocitos, 60, 72, 77, 94, 272 actividad de la G6PD, 195 alteraciones, 526 amplitud de la distribución (ADE), 14, 41 análisis de la piruvatocinasa, 162 anticuerpos frente a, 428 aspecto, 582 componentes, 16-7 concentrado, 451 cuerpos de Heinz, 270 defectos citoesqueléticos, 182 densidad, 14 diámetro, 14 elución de los anticuerpos, 217 estudios de supervivencia, 305 fragmentación. Vease Esquistocitosis fragmentos, 80 inclusiones, 84, 263 índices, 6, 30, 40 macrocíticos, 140 metabolismo, 186 métodos del folato, 150-2 microfotografía, 251 morfología, 163, 602 normales recubiertos de penicilina, 221 nucleados (EN), 32, 75, 84 protoporfirina (PE), 129, 133 reactivos, 427, 453 rutas glucolíticas, 187 selección y transfusión, 460-1 suspensiones, 426 tipo HPN, 228 vida media, 14 volumen (VE), 309-13 Eritrocitosis, 522 Eritrofagocitosis, 59, 90 Eritropoyesis, 71-5, 86, 101, 128, 133 Eritropoyetina, 517-8 Erizo de mar, 81-2 Errores debidos a la casualidad, 38 del observador, 131 en los recuentos celulares manuales, 580 fuentes, 104-5, potenciales, 155, 464 señales, 340-1 sistemáticos en los análisis, 539 técnicos, 336 Escala aritmética, 12 geométrica, 12 lineal, 12 logarítmica, 12 Escherichia coli, 342 Esferas crenadas, 76 Esferocitos, 71, 76, 79 Esferocitosis, 29, 71, 76-77, 526 hereditaria (EH), 77, 88, 177, 179-180, 182, 186, 272 Esfero-equinocitos, 76-7, 77 Esfigmomanómetro, 357 Especificidad, 539 Kidd, 426

Espectrina, 182 Espectro de luz visible, 167 Espectrofotometría, 170-1 Espectrofotómetro, 24, 122 Espectrometría, 168 de masas-cromatografía en fase gaseosa (EM-CG), 139 directa, 27 Espectrómetro, 24, 179, 197, 307, 308 Espectroscopia de la absorción, 171 Espinas ilíacas, 100, 108 Espiroquetas, 60 Esplenectomía, 78, 82, 54, 163, 270 Esplenomegalia, 62 Esquema de evaluación externa de la calidad nacional (NEQAS), 127, 242 para la valoración de la calidad externa en Gales (WEQAS), 127 Esquistocitos, 70, 80-1 Esquistocitosis, 71, 73-80-1 Esquizonte, 62 ESRChex, 513 Estado de los metabolitos, 139 Estándar(es) cero (δA0), 123 de referencia, 591-2 internacionales de práctica, 549 Estandarización, 561 Esterasa no específica (ENE), 281 Esterasas, 279-80 Estercobilina, Esternón, 99 punción, 100 Estibofén, 221 Estimaciones de la carga viral del plasma con VIH, 575 Estomatocitos, 79 Estomatocitosis, 73, 83 hereditaria (EsH), 83, 182, 186 Estreptocinasa 409 Estudios Doppler, 466 NEQAS, 402 Etanol, 100, 169 Etiquetado aleatorio, 315 European Community Bureau of Reference (BCR), 25 Cooperation for Accreditation of Laboratories (EAL), 548 Union Bureau of Reference (BCR), 400 Evaluación morfológica, 575 Exactitud, 538, 563 y comparabilidad, 541 Excreción urinaria, 155 Exploración con tomografía computarizada (TC), 319 Expresión de CD38, 300 Extensión(es) de la capa de leucocitos, 29, 59, 59-60 de la médula ósea microfotografías, 140-1 preparación, 51 tinción, 63-5 de sangre dimórfica, 75

examen, 57-8 de parásitos, 60 fijación con metanol, 56 leucoeritroblástica, 86 métodos de tinción, 55-60 microfotografía, 71-87, 90-97 preparación, 4, 51-2 realizadas en portaobjetos, 52 mal realizada, 31

F Factor(es) antinucleares (FAN), 517 de Fletcher, 328 de la forma, 39 de restricción homólogo (HRF), 224 de von Willebrand (vWF), 20, 326, 330, 416 análisis de inmunoabsorción ligada a enzimas, 359 de multímeros, 363 inmunoturbidométrico, 360 enfermedad, 346, 359, 369 función, 359 gel multímero, 366 patrones multiméricos, 367 proteasa disociadora, 223 Fitzgerald, 328 Hageman, 328 intrínseco (FI), 154 plaquetario, 14 V Leiden (FVL), 378-3, 389, 481, 485 VIII:C concentración, 359 Falciformación de los eritrocitos, 58 Fallo hepático, 82 Favismo, 78 FCSC (cuentas de Quantum), 291-2 Fe2+ (hierro ferroso), 114 Fe3+ (hierro férrico), 114, 122 Fenacetina, 78, 221 Fenotipo de McLeod, 81, 420 Inab, 228 Ferritina, 114-6, 116 de las células HeLa, 122 Ferrocianuro, 115 potásico, 25, 172 Ferrocinética, 314-5 Fiabilidad de las pruebas, 538 Fibrinógeno plasmático, 14, 410 Fibrinólisis, 390, 409 Ficoeritrina (PE), 288 Ficoll, 59 Fiebre, 62 Fijación al colorante, 182 en gel, 365 Filariasis, 66 Fitohemaglutinina (PHA), 486 Flebotomía bandeja, 1-3 procedimiento, 2-3 Flebotomistas, 1, 2, 3, 4 Flujo de barrido, 38

ÍNDICE ALFABÉTICO

Fluorescencia, 152 de la hibridación in situ (FISH), 300, 488-489, 489, 528 microscopia, 61 Fluoróforo, 153 Fluoruro sódico (NaF), 279 FOE. Véase Mediana de la fragilidad osmótica eritrocítica Folato eritrocitario, 14 Food and Drug Administration, 127 Formaldehído, 41 Formazán, 187 Fosfatasa alcalina-antifosfatasa alcalina (FAAFA), 293 Fosfato de potasio, 119 Fosfoenolpiruvato (PEP), 195 Fosfofructocinasa, 187 Fosfoglicerato cinasa (PGK), 187, 198 mutasa (PGM), 198 Fosfogluconato deshidrogenasa, 187 Fotodiodo, 37 Fotómetro, 27 Fotomultiplicador, 37 Fotones, 149 Fracción de reticulocitos inmaduros (FRI), 46 Fragilidad osmótica, 6 al incubar la sangre, 179-81 curvas, 179-81 en el estado de salud, 180 en las anemias hemolíticas, 182 métodos de registro alternativos, 180-1 prueba, 582 Fragmentación, 70-1, 379-80 FRI. Véase Fracción de reticulocitos inmaduros

tiempo de lisis (GLT), 183 Glicina, 169 Global System of Mobile (GSM), 583 Globulina de unión a hormonas sexuales (GLHS), 386 Glucoforina A (GPA), 420 B (GPB), 420 Glucosa-6-fosfato (G6P), 187 Glucosafosfato isomerasa, 187 Glucosilfosfatidilinositol (GPI), 227 Glutatión oxidado (GSSG), 187 peroxidasa, 78 prueba de estabilidad, 163, 197 reductasa, 187 Goma de acacia, 59 Goncalves, P. , Dr. , 502 GPI (glucofosfoinositol), 326 Grado de hipoxemia, 18 Gráfico de control, 566-7, 567 de Levey-Jennings, 567 de Youden (xy), 570, 570 hematológico, 542 Granulación tóxica, 53, 90, 90 Granulocitos, 42, 434-44 Gránulos azurófilos, 95 Grifo seco, 100 Grupo Europeo de Clasificación Inmunológica de las leucemias (EGIL), 302 FAB (Francés-Americano-Británico), 89 Grupos de genes de la globina, 234 Guía ISO/IEC 43, 549 Guidelines for Blood Transfusion Services, 425

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G Gametocito, 63 Ganglio linfático, 528 Gen BCL-1, 489 BCL-2, 489 de fusión BCR-ABL, 490, 492 FIP1L1-PDGFRA, 533 FUT1 (H), 415-6 FUT2 (Se), 415-6 TCR gamma, 495-6 Genes codificadores ABO, 415-7 Duffy, 420 Kidd, 420, Lewis, 418 MNS, 420 GeneScan, 495 Genética molecular de los antígenos plaquetarios humanos (HPA), 434 Genetically Modified Organisms Regulations (2000), 554 GEN-S, contador automatizado de sangre completa, 42 Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Ga3PD), 187, 199 Glicerol, 119 prueba de la lisis, 162

H Haptocorrina, 140 Haptoglobinas, 20, 116, 164-7 Hb. Véase Concentración de hemoglobina A, posición, 255 A2, 15, 237 C, posición, 254 Constant Spring, 483 F, 15 heterocigota D-Punjab, 74 Köln, 77, 236, 270 M, 236 S, posición, 254 St Mary’s, 77, 78 HbCO. Véase Carboxihemoglobina HCM. Véase Hemoglobina corpuscular media Health Service Circulars, 450 HELLP (hemólisis + elevación de enzimas hepáticas + bajo recuento plaquetario), 526 Hematíes, crenación, 7 Hematocrito (Hto), 4, 14, 15, 16, 20, 28, 30, 39-40, 184, 185, 309, 513, 563, 578 centrifugado, 29 Hematología, laboratorios con pocos recursos dirección del laboratorio, 583-4 disponibilidad de las pruebas, 574-5 mantenimiento

de la calidad de las pruebas, 576-7 de la fiabilidad de las pruebas, 576-7 organización de los servicios de laboratorio clínico, 574 pruebas hematológicas básicas, 577-82 esenciales, 575-6 recuentos de linfocitos T CD4+, 582 tipos de laboratorios, 573 unidades de peso y medida, 592 Hematólogo, 62 Hematoxilina, 109 y eosina (H&E), tinción con, 109 Hemofagocitosis, 59 Hemofilia A, 375 B, 375 Hemoglobina, 81-2 A2, 575 C, 205 cristales, 78, 84 enfermedad, 79, 84, 83-5 homocigosidad, 78, 79, con afinidad alterada para el oxígeno, 236 corpuscular media (HCM), 14, 16, 18, 20, 30, 162, 181, 237, 523, 568 cuantificación de la Hb A2, 255-259 F, 259-61 de las células falciformes, 251 del adulto (Hb A), 201 detección de la afinidad alterada, 254 de la Hb MS, 253 de laboratorio, 240-50 heterocigosidad, 77 homocigosidad, 77, 78-9 neonatal, 252 evaluación de la distribución intracelular de la Hb F, 261-2 fetal (Hb F), 234, 273 inestable, 236 interpretación de los valores de la Hb A2, 259 investigación de pacientes, 239-40 molécula, 233 pruebas para la Hb S, 251-2 S, homocigosidad, 84 síndromes talasémicos, 236-9 síntesis, 73 tetrámero, 236 variantes estructurales, 234-6 Hemoglobinización, 76 Hemoglobinometría, 24, 577 Hemoglobinómetros, DHT, 28 portátiles de lectura directa, 27-8 Hemoglobinopatías, 263, 521, 526 Hemoglobinuria de la marcha, 18 paroxística nocturna (HPN), 171, 223-8, 276, 318, 384 por frío (HPF), 206 Hemograma completo, 24, 380 Hemólisis, 3, 81, 140, 162 extravascular, 221

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Hemólisis (cont.) inducida por fármacos, 89 Hemopexina, 116, 167 Hemosiderina, 114-6, 116, 168 Hemosiderinuria, 223 importancia, 168 HemoTec Automated Coagulation Timer, 406 Hemox-Analyzer, 200 Heparina, 2-3, 5-6 análisis del anti-Xa, 406 cofactor II, 14, 389 de bajo peso molecular (HBPM), 404 no fraccionada (HNF), 404 respuesta al TTPA, 405 tratamiento, 403-9 trombocitopenia y trombosis inducidas por, (TTIH), 407 Hepatitis B, 310, 313 C, 310, 313 Hepatoma fibrolamelar, 156 Hepatomegalia, 62 Hepatopatía, 73-74, 140 alcohólica, 82 Hexocinasa, 187 Hibridación con oligonucleótidos aleloespecíficos, 481 Hidroclorotiazida, 221 Hidrops fetal con Hb de Bart, 238 Hidroxicarbamida, 72, 84, 92, 141, 523, 524 Hidroxiurea, 72 Hierro absorción a nivel molecular, 114 almacenamiento, 115 anemia por déficit de, 116 biopsia tisular, 118 captación y liberación, 115 déficit, 106, 128, 132 elementos respondedores al, (IRE), 115 estado, 118-9 estándar, 122 intercambio en el organismo, 114 quelantes, 122 radioactivo (59Fe), 313, 315 repleción, 124 sérico, 122 sobrecarga, 121, 128 terapia con, 131 tinción, 268 trastornos del metabolismo, 116, 117 utilización, 314, 314 Hipercromasia, 75 Hipercromía, 75 Hiperesplenismo, 523 Hiperglucemia, 40 Hipersegmentación, 92 Hipocromasia, 71, 74 Hipocromía, 74-5, 74, 75 Hipoesplenismo, 97 Hipotiroidismo, 140 Histocompatibilidad cruzada, 461-3 Histograma, frecuencia, 12, 12, 43, 545 Holotranscobalamina (HoloTC), 140, 146, 156 Homocigosidad para la hemoglobina S, 84 Homocisteína, 152 Homogeneidad de la muestra, 8

Hospital Transfusion Committees and Teams, 450 Hto. Véase Hematocrito

I IATA, instrucciones de embalaje, 556, 559 ICSH. Véase International Council for Standardization in Haematology Ictericia, 223 Identificación de anticuerpos, 457-9 Ilford 625, 25-7 Iluminación de Nomarski, 58 interferencial, 57 Imágenes, 307 por radionucleidos, 163 diversas, 320 Immunofenotipificación, 6, 59, 522 análisis, 100 introducción a, 287 métodos de estudio de los marcadores inmunológicos, 288-302 Immunoglobulina G (IgG), 117, 150, 207 M (IgM), 417 Immunoperoxidasa (IP), 302 Importancia de los detalles clínicos, 141-2 Inactivación del cromosoma X (ICX), 194, 375 Incertidumbre de la medición, 538 Inclusión en metacrilato, 109 Inclusiones de cadenas, 263 Incompatibilidad ABO mayor, 471 y menor, 471 menor, 471 Incubadora, 5 Índice de actividad media de la peroxidasa (MPXI), 43 de desviación, 569 de la transferrina, 126 de masa corporal magra (IMM), 312, 312 de variación, 541 Indio (111In), 309 Indometacina, 221 Infarto agudo de miocardio, 511 Infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), 62, 310, 523, 555, 564, 573 por VLTH-I (virus linfotrópico de células T humano tipo I), 96 vírica, 95 Inhibidor de la fibrinólisis activado por trombina (TAFI), 331 de la vía del factor tisular (TFPI), 326 Inmadurez, 71 Inmovilización con anticuerpos monoclonales de los antígenos de granulocitos (MAIGA), 438 plaquetarios (MAIPA), 434, 443 Inmunocitoquímica, 293 Inmunocromatografía, 519 INRatiometro, 339

Institute for Biomedical Science, 536 Reference Materials and Measurements (IRMM), 39, 562, 592 Instrumentación, 540-1 Instrumentos automatizados, 39, 43-4 Interleucina-6, 424 International Air Transport Association (IATA), 559 Council for Standardization in Haematology (ICSH), 2, 6, 15, 25, 29-30, 39, 45, 55, 122, 177, 273, 310, 311, 427, 511, 540, 562 Electrotechnical Commission (IEC), 553 Laboratory Accreditation Co-operative (ILAC), 549 Normalized Ratios (INR), 342, 400, 590 Organization for Standardization (ISO), 1, 549, 553, 562 Sensitivity Index (ISI), 342, 400, 590 Intervalos de referencia, 11-13, 12, 127-8, 156 Intoxicación por clorato sódico, 77 por plomo, 74 Inulina, 223 Investigación de la hemostasia, 332-4 afibrinogenemia, 356-57 anticoagulantes circulantes, 354-56 coagulación intravascular diseminada (CID), 373-5 componentes de la hemostasia normal, 326-32 defectos de la hemostasia primaria, 357-59 déficit de factores de la coagulación, 349-54 congénito, 375, 375 disfibrinogenemia, 356-57 enfermedad de von Willebrand, 359-72 estudio básico de la coagulación, 342-345 exploraciones de segunda línea, 345-9 hipofibrinogenemia, 356-57 notas del equipo, 334-35 prueba de la solubilidad del coágulo para el factor XIII, 372-3 pruebas de primera línea, 345 variables preanalíticas, 335-42 del control de calidad para el anticuerpo del factor intrínseco de la UKNEQAS, 153-4 del fenotipo, 375 hematológica, 473 serológica, 468, 473 Inyección de adrenalina, 19 IRMM. Véase Institute for Reference Materials and Measurements IRP1, 115 IRP2, 115 ISO. Véase International Organization for Standardization Isoanticuerpos, 434 Isoelectroenfoque (IEF), 240, 247, 248-49

ÍNDICE ALFABÉTICO

Isopropanol, 2-4 prueba de estabilidad, 253 Isotiocianato de fluoresceína (FITC), 288, Isoton, 290 II, 227 Isótopos radioactivos en hematología, 305-308 ferrocinética, 313-5 fuentes, 305 medición de la vida media plaquetaria, 321 de las pérdidas sanguíneas, 320-1 pruebas de compatibilidad, 319 visualización del bazo, 319, 20 volumen sanguíneo, 309-13

J Jeringas, 1, 106 de plástico desechables, 2 Joint Working Group on Quality Assurance, 546

K K2-EDTA, 28 Kernicterus, 168 Kininógeno de alto peso molecular (HMWK), 328

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L Lactato deshidrogenasa (LDH), 187, 528 Lactobacillus casei, 150 Lactoferrina, 6 β-lactoglobulina, 150 Lancetas, 1, 1-4 Lauril sulfato, 26 sódico, 24, 37 Lavado con gel, 365 L-cisteína, 228 L-dopa, 221 Leishmaniae, 60 Leishmaniasis, 61-2, 65, 523 Leptocitosis, 82, 82 LES. Véase Lupus eritematoso sistémico Leucemia, 41-284, 522 aguda, 528 bifenotípica, 297 de linfocitos T, 277 de células peludas, 278 de linfocitos T, 96 grandes granulares (LGG), 300 granulocítica crónica, 93, 94 linfoblástica aguda (LLA), 93, 95, 96, 275, 291-92, 486, 533 Philadelphia positiva, 96 linfoma de linfocitos T del adulto (LLTA), 301 megacarioblástica aguda, 297 mieloblástica, 109 mieloide, 102 aguda (LMA), 92, 269, 273, 291, 523 crónica (LMC), 84, 95, 273, 480, 490, 528 atípica, 95 mielomonocítica aguda, 283 crónica, 94

monocítica aguda, 281 prolinfocítica, 95-96 de células B (LPL-B), 298 de linfocitos T (LPL-T), 301 Leucoaglutinación, 6, 90 Leucocitos. Véase Recuento de leucocitos totales aglutinación, 41 agregados, 6 imágenes, 320 preparación de una extensión sanguínea húmeda, 57 recuento, 4, 18-9, 30, 94 Leucocitosis, 522 Leucopenia, 525 Leucopoyesis, 101 Levodopa, 146 Lieberkuhn, criptas de, 115 Límites de confianza, 12 de referencia, 11 Linealidad, 540 Líneas Lilley, 466 Linfadenopatía, 62, 528 Linfoblastos, 95 Linfocitos 67, 7, 15-16, 19, 42, 60, 94, 94-96, 525 B, 93 en la leucemia linfocítica crónica (LLC), 95, 95, 291, 299 granulares, 95 lobulados, 96 plasmocitoides, 95 recuento, 20 subtipos, 14, 15-16 T, 93 Linfocitosis, 522 Linfoma de Burkitt, 486 de las células del manto (LCM), 298 Linfomas, 99, 106, 522 no hodgkinianos, 296 Lipidemia, 148 Lipopolisacárido, 6 Lipoproteína (a) (Lp[a]), 380 de alta densidad (HDL), 380 de baja densidad (LDL), 380 de densidad intermedia (IDL), 341 de muy baja densidad (VLDL), 341 Lisado, 27 Lisis, 5, 167, 178, 183, 211, 219, 391, 424-5 de la placa de fibrina, 390, 391 demostración, 428 por anticuerpos fríos, 223 pruebas, 428 Litio, 6 LLA de linfocitos B maduros (LLA L3), 296 Loa loa, 65 Loiasis, 65 Lovibond Comparator, 169 Lumi-Phos, 150 Lumoagregómetro, 372 Lupus eritematoso sistémico (LES), 59, 80, 517 Lyphochek, 123

M Macrocitos, 72-3 hipocrómicos, 41 ovales, 72 policromáticos, 75, 77, 79 Macrocitosis, 72-3, 73, 524, 526 Macroestomatocitos, 79 Macrófagos, 106 Macroovalocitos, 72, 79 Maduración de las células mieloides, 106 Mancha en el tiempo cero, 188 Mapa de la placa para la determinación de la UIBC, 125 Marcado de cohorte, 316 Marcador de linfocitos B, 289 mieloide, 297 Marcapasos, 554 Masa eritrocitaria, 20 molecular relativa (MMR), 25, 330 Material estándar, 561 Media aritmética (χ), 11, 124 logarítmica del TP normal (LMNPT), 342 Mediana de la fragilidad corpuscular (FOE), 180 osmótica eritrocítica (FOE), 14 Medias de distribución aleatoria, 31 Medical Devices Agency, 36, 121, 126, 540 Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (MHRA), 334, 562 Medición del factor VIII, 356 Medio de resolución de mono y polinucleares (MPRM), 440 salino de baja fuerza iónica (LISS), 424, 426, 454 de fuerza iónica normal (NISS), 217, 426, 458 separador de linfocitos (LSM), 440 Médula ósea agujas de punción, 101-2, 102 desechables, 102 alteraciones de todas las líneas celulares, 526 aspiración, 100-103, 106 aspirada, examen, 103-5 biopsia, 99-111, 108 por trepanación, 106, 108 compensación de la anemia, 71 complicaciones, 108 en la leucemia mieloide aguda, 274 espacio, 108 esquema de examen sistemático, 105-6 examen de la trepanación, 575 extensión, 57, 103, 105 fallo, 240 frotis, 275 informe de ejemplo, 107 intervalos de normalidad en los recuentos diferenciales, 104 macrófagos, 62 microfotografía, 109-11

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Médula ósea (cont.) necrosis, 106 parásitos, 53 partículas, 270 población de linfocitos B, 289 progenitores eritroides, 17 recuentos celulares cuantitativos, 103-4 diferenciales, 103 suministro de hierro, 118, 127 tinción con violeta de metilo, 271 trépano Islam, 102 Jamshidi, 108 Megacariocitos, 59 Megaloblastos, 59, 87, 72, 140 Memoria de acceso aleatorio (RAM), 542 Menstruación, 117 2-mercaptoetanol (2-ME), 220 Mesurando, 538 Metahemalbúmina, 166-8 Metahemoglobina (Hi), 15, 24, 163, 171, 189, 253, 272 Metahemoglobinemia, 174, 222 Metamielocitos, 32, 59, 93 Metanol, 55-6, 100 Metilcelulosa, 59 α-metildopa, 221 Metilenetetrahidrofolato, 146 Metilmalonil-CoA, 152 Metiltetrahidrofolato (MTHF), 141 Metionina, 152 Método aparte del consenso, 570 cuantitativo de la capa de leucocitos (QBC), 61, 65 de concentración en el tubo capilar, 65 de detección del porcentaje, 339 de inmunodifusión radial (IDR), 165-166 de Ivy, 358 de Jonxis y Visser, 260-1 de la cianmetahemoglobina, 24 de la elución ácida, 272 de la hematina ácida de Sahli, 24 alcalina, 24 de la impregnación argéntica, 109, 111 de la oxihemoglobina (HbO2), 24, 26-7, 163, 190 de la papaína en dos tiempos, 427 de la placa de microtitulación, 120, 122 de los límites del acuerdo, 541 de Low, 427 de Perls, 103 de química húmeda, 169 de referencia, 562 de Romanowsky, 90 de tasa, 339, 339 de tinción con Azur B-eosina Y, 53-4, 61 de Jenner-Giemsa, 53, 56 de May-Grünwald-Giemsa, 54-5, 61, 69, 109, 109, 140-1, 275, 280 rápida, 57 de Field, 57, 70 del microhematocrito, 28-9

multimérico no radiactivo, 363 operativo, 562 QBC. Véase Método cuantitativo de la capa de leucocitos recomendado, 562 seleccionado, 561 Métodos automatizados, 124-6 de demostración de los anticuerpos, 439 Metosulfato de fenazina, 187 Metotrexato, 147 Metrizoato de sodio, 59 Microangiopático, 81 Microcitos, 73 hipocrómicos, 75 Microcitosis, 40, 73, 74, 73-5, 75, 75 Microfilaria, 60, 61, 64 Micropartículas de látex, 333, 360 Micropipeta, 29 Microscopia electrónica de barrido, 58, 79, 88-9 Microscopio, 600-1 mantenimiento de rutina, 601-2 Microsferocitos, 80-1 Microsoft Excel, 123 Picture It, 363, 365 Microtainer, 4 Mieloblastos, 60, 93 Mielocitos, 32, 60, 93 Mielodisplasia, 528 Mielofibrosis, 108-109, 223 colágena, 111 idiopática, 72, 87, 523, 528 secundaria, 2 Mieloma múltiple, 523 Mielomatosis, 86, 527 Mieloperoxidasa (MPO), 273-74, 274 tinción, 273 Migración electroforética, 195 Minitab, 123 Mioglobina, 174 Moda, 11, 12 Molécula de cadena única (scu-PA), 331 Moléculas de fluorocromo soluble equivalente (MFSE), 291 Monitorización consecutiva, 570 Monocitopenia, 526 Monocitos, 8, 16, 19, 42, 60, 94 activación, 6 recuento, 20 Monocitosis, 140, 522 Monómero, 25 Mononucleosis infecciosa (MI), 95, 515-7 Monotioglicerol (MTG), 150 Monóxido de carbono, 174 Morfología, 522 celular, 5, 521 de la célula sanguínea anomalías de los hematíes, 82-6 basófilos, 93 células espiculadas, 79-82 daño a los eritrocitos, 75-79 efectos de la esplenectomía, 87 del almacenamiento, 6, 6-7

del hipoesplenismo, 87 eosinófilos, 93 eritrocitos irregularmente contraídos, 77-78 eritropoyesis anómala, 71-5 examen de las extensiones sanguíneas, 70 formación inadecuada de hemoglobina, 74-5 microscopia electrónica de barrido, 87-8 morfología de los eritrocitos, 70-2 de los leucocitos, 87, 90 plaquetaria, 96-97 neutrófilos polimorfonucleares, 90, 90-3 MPXI. Véase Índice de actividad media de la peroxidasa Muestra urinaria en el momento medio de la micción (MUMM), 380 Muestras de sangre capilar por punción cutánea, 1 descongelación, 336 fetales, 464 manipulación, 338 Multinuclearidad eritroide hereditaria asociada con una prueba de suero acidificado positiva (HEMPAS), 225 Mutación mediterránea de la G6PD, 497 Mutaciones en la región no traducida (UTR), 481 Mycoplasma pneumoniae, 206

N NADPH-metahemoglobina reductasa, 187 α-naftil acetato esterasa (ANAE), 279, 282 butirato esterasa, 279, 281 Naftol AS-D cloroacetato esterasa, 280-3 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), 5, 335, 562 Health Services Medical Devices Agency, 334 Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), 151, 425, 591 Measurement Accreditation Service (NAMAS), 548 Pathology Accreditation Advisory Council (NPAAC), 548 Physical Laboratory, 27 NCCLS. Véase National Committee for Clinical Laboratory Standards Nefelometría, 164, 339 Negro Sudán B (SNB), 274, 275-2 Neoplasias mieloides, 523 NEQAS (Esquema de evaluación externa de la calidad nacional), 561 Neutrofilia, 522 Neutrófilos, 6, 15-16, 60, 73, 90-2, 93, 94, 140-1 apoptósicos, 8 coeficiente de linfocitos, 16, 19 hipersegmentados, 92 hipogranulares, 91 hipolobulados, 93 picnóticos (apoptosis), 93

ÍNDICE ALFABÉTICO

Neutrófilos (cont.) polimorfonucleares, 7, 30, 90 recuento, 20 Neutropenia, 526, 528 Nicotina adenina dinucleótido fosfato (NADPH), 187, 187 No transferrina, 116 No trombogenicidad, 328 Nomenclatura de Fisher, 418 Nomifensina, 221 Nonidet P40, 25 Norma(s) europea (EN 14820), 2 europeas (EN) sobre prácticas de laboratorio médico, 549 para el control de sustancias peligrosas para la salud (COSHH) (2002), 554 sobre radiaciones ionizantes (2000), 554 Normoblastos, 87, 140 Núcleos, 91, 94-6 Nuevo azul de metileno, 34-5, 33, 32, 45, 271

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O Ocular de Miller, 35 OptiMAL, 519 Ordenadores del laboratorios, 542-3 Organización Mundial de la Salud (OMS), 269, 337, 400, 542, 553, 575, 577 categorías de enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, 532 clasificación, 90, 296, 532 de la leucemia mieloide aguda (LMA), 530 de los síndromes mielodisplásicos (SMD), 531 International Laboratory for Biological Standards, 562, 591 norma internacional, 25, 120 preparación de tromboplatina de referencia internacional, 590 revisión global de OMS/WFH, 376 Organización/dirección del laboratorio acreditación, 547-9 auditoría del laboratorio, 547-9 comparativa, 550 estándares internacionales de práctica, 549 estructura y función de la dirección, 535, 8 fiabilidad de las pruebas, 538 instrumentación, 540-1 procesamiento de datos, 541-3 selección de las pruebas, 539-40 Orion, equipo de inmunoanálisis enzimático, 127-8 Oscilógrafo, 37 Osmolalidad, 38 Ovalocitos, 72, 87 Ovalocitosis, 78-9 del sudeste asiático (OSA), 79, 83, 182, 186 Oxazine 750, recuento de reticulocitos con, 45 Óxido nítrico (NO), 326

P P. falciparum, 62, 63 P. malariae, 62, 63, 519 P. ovale, 62, 63, 519 P. vivax, 62, 63, 519 Pancitopenia, 62, 526 Panel de anticuerpos monoclonales, 298 Papel de gráfico semilogarítmico, 12 Par de bases (pb), 507 Parásitos del paludismo, 61 Patrón oro, 131 para el diagnóstico, 65 prueba, 407 PCR-CL, 341 p-dimetilaminobenzaldehído, 170 Pelger-Huët anomalía, 92 células, 92, 526 Penicilina, 221-2 Perfiles de coágulos, 340, 341 Periodo de semivida, 155, 305, 308, 390 Peroxidasa de rábano, 119, 119, 120 Peróxido de hidrógeno, 119, 163 Persistencia hereditaria de la hemoglobina fetal (PHHF), 234 Peso molecular monomérico de la hemoglobina, 27 Pesos atómicos, 593 6PG deshidrogenasa (6PGD), 187 pH, 25, 34, 38, 56, 58, 82, 109, 119-20, 149, 167, 243-5, 424 en la lisis, 22 Picnocitos, 70 Picnocitosis, 78 infantil, 78, 79 Picnosis nuclear, 105 Pilas de monedas, autoaglutinación, 85-6 Pipeta Pasteur, 5, 34 Pipetas (mecánicas) automatizadas, 595, 600 Piropoiquilocitosis hereditaria (PPH), 79, 186 Placa de tórax (PT), 380 Plan de valoración externa de la calidad (EQAS), 570 Plaquetario satelitismo, 97 Plaquetas, 327-8, 434-44, 527 agranulares, 97 agregación, 366-72, 371 agregados, 6 amplitud de la distribución (ADP), 45, 140 anisocitosis, 45, 97 gigantes, 97, 97 glucoproteína (GP), 434 plasma pobre en (PPP), 336, 357 rico en (PRP), 370, 383, 408 preparación, 440 prueba de inmunofluorescencia, 437, 441 recuento, 4, 6 14, 19, 32, 44, 45, 97, 163, 345, 404, 575, 580-1 reticuladas, 45 separación de eritrocitos, 59-60 supervivencia en la enfermedad, 321 Plaquetocrito, 45 Plasma aclaramiento del hierro, 313, 314 almacenamiento, 336, 426

AMM sérico, 152 atrapamiento, 29, 40 diferencias entre suero y plasma, 5 ferritina, 122 glucoproteína, 116 hematíes libres, 5 hemoglobina (Hb), 14, 161 homocisteína, 146 transporte del hierro, 115 viscosidad, 14, 20, 515 volumen, 19, 310-1 Plasmina, 331 Plasmodia, 60 Plasmodium falciparum, 60, 61, 518, 575 Población caucásica, 417 de hematíes dimórficos, 74 de referencia, 11 doble, 318 curva, 318 normal, 12 Poiquilocitos, 71-2, 75, 83, 89 con cola, 72 de células falciformes (SC), 83, 84, 84 en lágrima, 72, 75, 87 Poiquilocitosis, 58, 71, 72-5, 75 Policitemia, 18, 171, 522 Policromasia, 71, 86 Polietilenglicol (PEG), 387, 430 Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), 264 genético C677T, 146, 154 Política de Clinical Laboratories Improvement Amendments (CLIA 1988), 548 de seguridad por departamentos, 553 Ponceau, 249 Porcentaje acumulado, 546 Porfiria, 171 eritropoyética, 74 congénita, 171 Porfirinas, 170-1 Porfirinuria, 171 Porfobilinógeno, 169-70 Postesplenectomía, 85, 89 Postransfusión, 77 Potasio, 115 dihidrógeno fosfato (KH2PO4), 25, 26, 57 Potencial de trombina endógena (PTE), 395 PPZ. Véase Protoporfirina de zinc Precauciones biopeligrosas especímenes, 555-59 recogida y manipulación de la sangre, 1 Precisión, 538, 540, 561 Precursor de Kell (Kx), 81 Preparación(es) de los sueros de prueba, 120 de referencia, 561-63 del hemolizado, 150 del material de cristal, 592 húmedas, 64 Presión parcial de oxígeno (pO2), 198, 200 Principio de transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET), 491

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Procedimiento(s) estadísticos, 11-12, 594-5 normalizados de trabajo (PNT), 549, 553 posflebotomía, 3 Procesamiento de datos, 541-2 Productos de degradación de la fibrina/fibrinógeno (PDF), 344, 405 Program for Appropriate Technology for Health (PATH), 519 Programa de mejora del laboratorio, 550 Proliferación de fibroblastos, 111 Prolinfocitos, 96 Protección de la radiación, 305-9 Proteína 2 rica en histidina (HRP-2), 186, 518 C (PC), 14, 380 activada (PCA), 389 análisis, 385-90 antígeno, 386 resistencia, 388-389 reactiva (PCR), 131-2, 341, 511, 591 de Kell, 420 de unión del C4b (C4bBP), 387 fijadora del folato (PFF), 150 P53, 300 promielocítica (PML), 296 reguladora S (PS), 14, 20 análisis, 386 déficit, 385 Protoporfirina, 171 de zinc (PPZ), 129, 171 Protrombina y proconvertina (P&P), 399 Prueba(s) a la cabecera del paciente, 545 básicas de coagulación, 574, 575 citoquímica, 194 Clearview, 517 cruzadas serológicas, 452 cualitativas, 571 de aglutinación de granulocitos (GAT), 438 de anticoagulante lúpico (LAC), 336, 380-4 de anticuerpo inmunofluorescente, 516 de antiglobulina, 90, 429-1 directa (PAD), 162, 205, 208, 211, 429 indirecta (PAI), 208, 422, 430 de células de LE, 517 de Coombs, 211 de detección, 521 no invasivas, 28 de Donath-Landsteiner anticuerpos, 209 directa, 219 especificidad, 220 indirecta, 219 en dos etapas, 221 intervalo térmico, 220 de cinc de Schlesinger, 169 de función renal, 163 de Ham, 163, 223, 226, 228 de inhibición de la tromboplastina diluida, 383 de inmunofluorescencia de granulocitos (GIFT), 438 de Kleihauer, 467 de lisis

en sucrosa, 163, 223, 224 en suero acidificado (prueba de Ham), 163, 223, 224-225, 528 de neutralización de la protamina, 407 de pirimidina-5’-nucleotidasa (P5’N), 74, 191-2 de polibreno directo, 213 de quimioluminiscencia de granulocitos (PQLG), 438 de respuesta en fase aguda, 511-516 de Schilling, 144, 155, 156, 305 de Schum, 162, 167 de solubilidad de la Hb S, 251, 273 de tiempo de lisis con glicerol acidificado (AGLT), 183 de un tubo, 582 de veneno de cobra, 223 en los centros de atención (POCT), 1, 26, 36, 403, 545-6 en placas, 428, 516, 518 en tubo, 428 semicuantitativas, 571 sobre porta de Clearview, 517 suplementarias para el paludismo, 518-90 Puercoespín, 81-2 Punción cutánea, 3 en lactantes, 4 del ilion, 100 Punteado basófilo, 70-71, 74, 72-6, 74, 255 Puntos de Schüffner, 53 Puntuación ID, 569 Púrpura postransfusional (PPT), 435 trombocitopénica autoinmune postesplenectomía, 85 trombótica trombocitopénica, 80

Q QIFIKIT (Dako Cytomation), 292 Q-PCR análisis, 505-6 Universal Master Mix, 492 QR-PCR, análisis, 493 Quantitative Clinical Chemistry, 200 Quantum Simply Cellular (QSC), 291-2 Quemaduras graves, 81 Queratocitos, 79, 81, 81 Quimioterapia, 46 Quinidina, 221 Quinina, 221

R R&D, equipo de inmunoanálisis enzimático, 127-8 Radioinmunoanálisis HoloTC, 156 Ramco, equipo de inmunoanálisis enzimático, 127 Rango de celularidad, 104 Rasgo de células falciformes, 482 de la Hb C, 236, 240 talasémico β, 78 Ratio mieloide:eritroide, 106 RsTf/log10 ferritina, 133

textarina/ecarina, 383 RE. Véase Recuento eritrocitario Reacción(es) al azul de Prusia (Perl), 268 antígeno-anticuerpo, 424 citoquímicas, 284-5 de la fosfatasa ácida, 276-7 de Perls, 73, 109, 168, 267, 270, 284 en cadena de la polimerasa (PCR), 419, 478-81, 479, 482-3, 484, 497, 499-501, 507, 519, 575 cuantitativa en tiempo real (QR-PCR), 491, 493 transcriptasa reversa (TR-PCR), 480, 490, 502-4 leucemoide, 92 transfusionales hemolíticas (RTH), 421 Reactivos, 590-1 de Bøyum, 59 de Ehrlich, 169 de Ellman, 196 de referencia, 591-2 DTNB, 197 Receptor de la transferrina (RsTf), 115 del linfocito T (TCR), 289, 296, 480, 496 endotelial de la proteína C (PC), 326 Recién nacido enfermedad hemolítica, 464-9 serología prenatal, 464-9 Recuento absoluto de reticulocitos, 34 corporal total, 156 de basófilos, 30 de leucocitos, 6, 14, 15-16, 20, 521, 563 totales, 41 de reticulocitos, 45 con auramina O, 46 diferencial de leucocitos, 104, 521 método longitudinal, 31 en almenas, 31 eritrocitario (RE), 4, 14, 15-16, 20, 28, 37, 563 manual de células, 28 del diferencial de leucocitos, 30-2 por impedancia, 37 sanguíneo efectos del almacenamiento, 6 variaciones fisiológicas, 16-20 total de células nucleadas (TCN), 32 Redes neurales, 43 Referencia alternativa, método, 29-30 Región de Golgi, 274 Registros de mantenimiento, 541 Requisitos de CLIA ‘88, 548 Resistencia a la aspirina, 409, 410 a la proteína C activada (APCR), 336, 379, 388 Resonancia magnética (RM), 319 Reticulina, 109 Retículo endoplásmico, 91 Reticulocitos, 15-16, 271 colorantes, 34

ÍNDICE ALFABÉTICO

Reticulocitos (cont.) de estrés, 34 estimulados, 34 fracción de reticulocitos inmaduros (FRI), 45 inclusiones eritrocíticas, 35 índice, 34 métodos de fluorescencia para el recuento, 35 microfotografías, 33 porcentaje, 35 recuento, 6, 14, 32-36, 34-5, 45 Rifampicina, 221 Royal College of Pathologists, 536, 550

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S s-adenosil homocisteína (sAH), 153 Sal de sodio, 6, 221 Salicilazosulfapiridina, 221 Salino tamponado con fosfato (PBS), 38, 182, 360, 453 con Tris (TBS), 125, 294 Sangre anticoagulación, 51 capilar concentración de hemoglobina (Hb), 4 diferencias con sangre venosa, 4 lisada, 65 recogida, 3-4 coagulación, 328-31 del cordón umbilical, 468 desfibrinada, 5, 602 muestras, 451 oculta en heces (SOH), 380 parásitos, 60, 64 policitémica, 29, 34 recogida de especímenes, 2 y manipulación, 1-8 red de coagulación, 328 vaso, 326-7 venosa, 349 diferencias con la sangre capilar, 4 recogida, 1-3 viscosidad, 20 volumen, 14 Saturación de la transferrina, 14 SE-223 70, 43 Second National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES II), 130 Secuestro, 320 Segmentos variables, diversos y de unión (VDJ), 494 Seguridad del laboratorio diseño de las instalaciones, 554-5 documento de la política, 554 eliminación de residuos, 558 especímenes biopeligrosos, 555-58 transporte de las muestras, 558-559 Selección de las pruebas, 539-40 Sensibilidad, 539 Señalización, 43 Separación por doble densidad de linfocitos y de granulocitos, 440 Septicemia, 106

Serie Sysmex SE, contador automatizado de sangre completa, 42 Serología prenatal, 464 Serpiente Agkistrodon rhodostoma, 349 Bothrops atrox, 349 Sesgo, 539 Seudoaglutinación, 58 Seudopolicitemia, 522 Seudotrombocitopenia, 96 Sharp-X, 3 SHOT (serious hazards of transfusion), 547 Sida. Véase Síndrome de la inmunodeficiencia adquirida Sideroblastos, 267-73 Siderocitos, 267-73 Sifón de mercurio, 37 Significado clínico, 571 Síndrome compartimental glúteo, 108 de Behçet, 392 de Bernard-Soulier (SB-S), 97, 369, 372, 527 de Chediak-Higashi, 91 de la inmunodeficiencia adquirida (sida), 43, 515, 573 de la plaqueta gris, 97, 97 de Lesch-Nyhan, 140 de Zieve, 222 hemolítico-urémico, 80 mielodisplásico (SMD), 72-3, 83, 91, 92, 269, 273, 523, 524, 529 Síntesis de ADNc, 504 de cadenas, 234 del hemo, 169 Sistema Abbott 3500 Cell-Dyn, 42 4000 Cell-Dyn, 43 Architect, 149 AxSYM, 121, 149 IMx, 121, 149-50-4 recuento, 37 Beckman Coulter Access, 121 Chiron ACS:180, 121 Colton, 421 de activación por contacto, 329 de grupos sanguíneos ABO, 414 de impedancia-abertura, 39 de Kell, 420 de Kidd (JK), 421 de mutación refractario a la amplificación (SMRA), 483 de puntuación para la leucemia linfocítica crónica (LLC), 298 para las leucemias agudas bifenotípicas, 297 de recuento, 37 Beckman-Coulter, 37 de Roche, 37 Sysmex, 37 de tránsito rápido, 545 de tubo al vacío, 2 DELFIA, 121

Dombrock, 421 fibrinolítico, 331 HemoCue, 28 Kx, 420 Nichols Advantage, 127 PFA-100, 358 Roche Elecsys 2010, 121, 149 Wallac Auto, 121 Welcan, 537 Yt (Cartwright), 421 Sitio de amplificación creado por enzimas de restricción (ACRES), 481, 485 Sobrenadante rico en leucocitos (LRS), 440 Software del genotipificador (ABI), 497-8 Solución ácido-citrato-dextrosa (ACD), 309, 563 conservante, 587-88 de Alsever, 5-6 de barbital sódico, 120 de bromelina, 427 de Hanks, 288, 291 de naranja de acridina, 35 de papaína (método de Low), 427 estándar de HiCN, 163 salina de azur B, 34, 54-5, 61 Sondas, 492 Sondeo Q, 550 Southern blotting, 499, 507 Streptokinase haemolyticus, 409 Subtipos de LMA según la clasificación francesa-americana-británica (FAB), 297, 530, 532 Succinil coenzima A, 152, 169 Suero ácido metilmalónico, 146 almacenaje, 426 análisis de la B12, 148-50 bilirrubina, 168 concentraciones del receptor de la transferrina (RsTf), 127 diferencias con el plasma, 5 ferritina, 128 folato, 14 glucoproteína, 116 haptoglobina, 14 hierro, 14 mapa de la placa para la determinación de hierro, 123 métodos del folato, 150 salino fisiológico, 36 tubos separadores, 5 vitamina B12, 14 Sulfahemoglobina (SHb), 24, 163, 171 Sulfahemoglobinemia, 222 Sulfato azul de Nilo, 189 de amonio, 100 de hemoglobina, 24 Sulfuro de hidrógeno, 172 Sysmex XE2100, 43

T T. b. gambiense, 65 T. b. rhodesiense, 65 T. b. cruzi, 65 Tabaquismo, 18-20

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ÍNDICE ALFABÉTICO

Talasemia, 29, 72, 74 evaluación del estado del hierro, 263 investigación de la sospecha, 254 β mayor, 72-5, 80-1, 85, 87, 89, 179, 252, 262, 271, 470, 483 métodos de investigación, 255 pruebas de laboratorio, 238 síndrome clínico, 236-7 variantes talasémicas estructurales, 238-9 Tamaños de los tubos, 592 Tampón, 588-90 de carbonato sódico, 119 de lisis de los eritrocitos (RCLB), 502 fosfato isoosmótico, 34, 58 HEPES (N-2-hidroxietil piperazina-N’-2ácido etanosulfónico), 55, 61 Tris-ascorbato-hierro, 125 Tris-HCl/EDTA, 193 Tarjetas de anticuerpos, 460 TCN. Véase Recuento total de células nucleadas Tecnecio (99mTc), 309-10 Técnica(s) de adherencia de eritrocitos en fase sólida (SPRCA), 443 de denudado con cloroquina, 437-38 de recuentos sanguíneos automatizados, 24, 36-7, 44 de sumergir y remojar, 57 hematológicas amplitud de la distribución de la hemoglobina, 41-2 eritrocítica (ADE), 41 concentración de la hemoglobina, 37 contadores de células sanguíneas automatizados, calibración, 46 electrónicos, fiabilidad, 37-9 espectrometría directa, 27 gráficos de los instrumentos automatizados, 42 hematocrito, 28, 39-40 hemoglobinometría, 24 hemoglobinómetros portátiles de lectura directa, 27-8 índices eritrocíticos, 30, 37 método de la cianmetahemoglobina, 24-6 de referencia del International Council for Standardization in Haematology (ICSH), 29-30 del cianuro de hemoglobina, 24-6 del microhematocrito, 28-9 radioisótopos diagnósticos, 305-21 recuento celulares manuales, 30 de basófilos, 30 de eosinófilos, 30 de eritrocitos, 37 de leucocitos totales, 41 de plaquetas, 32, 44-5 de reticulocitos, 32-34, 45 diferencial automatizado, 42-3 manual del diferencial de leucocitos, 30-2

sanguíneos automatizados, señalización, 47 sistemas de recuento, 36 técnicas de recuento sanguíneo automatizado, 36-1 volumen corpuscular medio, 39-40 Temperatura de disolución (TD), 481 Terapia anticomicial, 141 antiplaquetaria, 410 profiláctica, 404 trombolítica, 409-10 Tercera edad, 17 Tert-butildimetilsilil del AMM, 152 Tetrabromofluoresceína, 53 Tetraciclina, 221 Tetracloruro de carbono (CCl4), 241 Tetrafluoroborato, 54 Tetrámeros de cadenas, 263 Tetrametilbencidina, 163 Thermus aquaticus, 478 Thrombotest de Owren, 400 Tiempo de Ancrod, 349 de coagulación activada (TCA), 405 de cefalina caolín (KCCT), 343 del caolín (TCC), 381, 382 de lisis de euglobulina, 14, 390 de protrombina (TP), 14, 328, 342-3, 380, 399-401, 575 de reptilase, 349 de respuesta tras la llegada de la prueba (TRT), 545 de trombina (TT), 14, 349, 399 de tromboplastina parcial activado (TTPA), 14, 328, 341, 343, 370, 400 del veneno de la víbora de Russell diluido (TVVRD), 381-2 parcial de tromboplastina con caolín (PTTK), 343 Tinción automatizada, 56-7 citoquímica, 100 con azul de Prusia, 268, 270 con bromuro de etidio, 495 con eosina, 109 de Giemsa, 54, 55-6, 60, 62 de gotas gruesas, 60 de Jenner, 53-2, 56 de las cadenas ligeras de la inmunoglobulina de superficie, 290 de Leishman, 53, 55, 56, 61, 275 de los frotis de médula ósea, 575 de May-Grünwald, 55 de Perls, 53, 85, 100, 106, 223 de Romanowsky, 53-5, 58, 283 extensiones sanguíneas, 77 frotis, 278 microfotografías, 56 de Wright, 53 doble, 289 en lecho horizontal, 57 fluorescente, 35 normalizada de Romanowsky, 55-6 simple, 289

Tiocianato, 54 de guanidina (GTC), 502 Tipificación ABO, rápida, 463-64 D rápida, 463-64 Rh D, 214 sanguínea anticuerpos, 575 pruebas de histocompatibilidad cruzada, 574 Tipos de autoanticuerpos, 206 Titulación, 217 de anticuerpos, 433-4 Títulos de aglutinación, 218, 332 Tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), 307 por emisión de positrones (PET), 307, 320 Tosoh Eurogenetics, 150 Transcobalamina, 149 Transfusión sanguínea desarrollos recientes, 450-1 detección de anticuerpos, 457-9 determinación del grupo D, 453-57 enfermedad hemolítica del recién nacido, 464-9 identificación de los anticuerpos, 459-60 investigación de una reacción a la transfusión, 471-72 pruebas de compatibilidad, 469-71 de histocompatibilidad cruzada, 461-3 reacción a, 471 selección y transfusión de eritrocitos, 460-1 serología prenatal del recién nacido, 464-8 sistemas de compatibilidad pretransfusión, 450-2 tipificación ABO, 452-32 transfusiones urgentes, 463-64 Transporte de las muestras, 558-9 Trasplante de células madre (TCM), 492 Trastorno(s) leucocitarios, 527-8 linfoproliferativos crónicos, 528 mieloproliferativo (TMP), 97, 273, 380, 528 Tratamiento con anticoagulantes orales estandarización del tratamiento, 400 selección de pacientes, 399-400 Triatominae, 64 Trifosfato de adenosina (ATP), 185 Triglicéridos (TG), 148, 380 Trimetiltionina, 53 Triosa fosfato isomerasa, 187 Tripanosomas, 60 Tripanosomiasis, 64¸ 62-5 africana, 64, 62 americana, 64 Triton X-100, 25, 61 Trofozoítos, 63 Trombastenia de Glanzmann, 527 Trombocitemia, 96 Trombocitopenia, 96, 321, 407, 526 Trombocitosis, 523 Tromboelastógrafo, 395

ÍNDICE ALFABÉTICO

Tromboembolismo venoso (TEV), 380, 483 Trombofilia déficit de la proteína C (PC), 385-90 estados trombóticos heredados, 384-5 factor VIIa, 395 hiperreactividad plaquetaria, 394 homocisteína, 395 introducción, 379 marcadores de activación de la coagulación, 395 prueba global de coagulación, 395 pruebas del anticoagulante lúpico (LAC), 380-4 sistema fibrinolítico, 390-40 β-tromboglobulina, 14, 20 Tromboplastina internacional de referencia, 342 Tromboplastinas, 342, 400, 401-3 Trombopoyesis, regeneración, 45 Trombosis, diagnóstico, 380 Tromboxano A2 (TXA2), 327 B2 (TXB2), 328 Trypanosoma brucei gambiense, 62 rhodesiense, 62 cruzi, 64 TTPA. Véase Tiempo de tromboplastina parcial activado Tuberculosis, 94, 108, 523 Tubos al vacío recubiertos de silicona, 2 de cristal de cuarzo, 27 ópticos equivalentes, 27 Turbidez, 24 nivel, 340, 341 Tween 20, 119

U

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United Kingdom Accreditation Service (UKAS), 548 Clinical Pathology Accreditation Ltd (CPA), 548

Medical Devices Agency (MDA), 516, 546, 562 Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (MHRA), 36, 121 National Blood Service, 463, 473 External Quality Assessment Scheme (EQAS), 453, 569 Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), 562 Ultrasonidos, 319 Ultravioleta (UV) fluorescencia, 261 luz, 169, 187 Unopette, 4 Uremia, 82 Urobilina, 168-9 Urobilinógeno, 168-9 Uroporfirina, 169-171 Utilidad de la prueba, 539

V Vacuolas, 7, 91 Valor neonatal medio, 197 Valoración del volumen de trabajo, 537 externa de la calidad (EQA), 561, 577 Valores normales de referencia, 13, 13, 13-16 Variaciones fisiológicas, 104-5 Variantes estructurales, 240 Vasoconstricción, 326 VCM. Véase Volumen corpuscular medio Vector, 507 Velocidad de sedimentación globular (VSG), 5, 15, 20, 131, 511 Veneno de la Pseudonaja textilis, 383 de la víbora de Russell (RVV), 381 Verosimilitud, ratio, 539 Vía de Embden-Meyerhof, 186-187 Vida media celular (VCP), 318 Virkon, 556 Virus

de Epstein-Barr, 515, 526 de la hepatitis, 555 Viscosidad de la sangre total, 515 Vitamina B12, 148 análisis, 8, 528 pruebas de absorción, 305 VLin integral, 339, 340 Volumen corpuscular medio (VCM), 5, 14, 15-16, 20, 30, 39-40, 73, 131, 140, 162, 181, 205, 237, 563, 568 plaquetario medio (VPM), 20, 45 sanguíneo (VS), 305 total (VST), 310 VPM. Véase Volumen plaquetario medio VSG. Véase Velocidad de sedimentación globular

W Westergren método, 512 tubo, 6 Western European Laboratory Accreditation Co-operation (WELAC), 548 Wratten 74, 25-27 Wright-Giemsa, 53 Wuchereria bancrofti, 65

X XE2100, contador automatizado de sangre completa, 42 Xerocitosis hereditaria, 182 Xilol, 57

Y Yodo radioactivo (125I), 309, 363

Z ZAP-70, 291, 299, 300 Zidovudina, 524 ZZAP prueba de absorción, 210 reactivo, 214 tratamiento, 214

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